BROADCASTS.com

b'Trotz erfolgreicher Resektion des Prim\\xe4rtumors sterben bis heute ca. 40% aller Brustkrebspatientinnen an den Folgen der Metastasierung. Inzwischen ist zunehmend anerkannt, dass wenige selektierte Tumorzellen f\\xfcr die Progression der Erkrankung und eine Therapie-Resistenz verantwortlich sind. Es ist deshalb fraglich, ob genomische Ver\\xe4nderungen, die zur Disseminierung f\\xfchren, entdeckt werden k\\xf6nnen, wenn die Masse der Zellen eines heterogenen Prim\\xe4rtumors untersucht wird. Einzelne Tumorzellen disseminieren in ektope Organe, wie das Knochenmark, und gelten als die Vorl\\xe4ufer der metachronen Metastasen. Eine genetische Analyse dieser Zellen k\\xf6nnte zur Entdeckung neuer Zielstrukturen f\\xfcr adjuvante Therapien f\\xfchren. Um genomweit und hochaufl\\xf6send genomische Aberrationen identifizieren zu k\\xf6nnen, wurde im Rahmen der vorliegenden Dissertation ein Protokoll entwickelt, das Array-CGH-Analysen von einzelnen Zellen erm\\xf6glicht. Hierf\\xfcr war es notwendig ein Verfahren zur Aufreinigung und Amplifikation von BAC-DNA zu entwickeln, die Bedingungen zur Array-Herstellung zu optimieren und ein Hybridisierungsprotokoll zu etablieren. Der daraufhin hergestellte, 3000 BAC-Klone umfassende 3K BAC-Array mit einer mittleren Aufl\\xf6sung von 1 Mb war bei der Analyse amplifizierter DNA aus Einzelzellen konventionellen BAC- und Oligonukleotid-Arrays \\xfcberlegen. Bei Hybridisierungen von Einzelzell-DNA mit bekanntem Karyotyp wurde bei normalen Zellen ein balanciertes Profil, bei Einzelzell-DNA eines Patienten mit Trisomie 21 die zus\\xe4tzliche Kopie des Chromosoms 21 und bei Einzelzell-DNA von T47D-Zellen der komplexe Karyotyp in \\xdcbereinstimmung mit der Literatur dargestellt. Zus\\xe4tzlich wurden Kriterien zur Auswahl zuverl\\xe4ssig hybridisierender BAC-Klone identifiziert und ein Assay zur Vorhersage einer erfolgreichen Array-CGH Analyse von Einzelzell-Amplifikaten entwickelt. Bei der Untersuchung einzelner disseminierter Tumorzellen aus dem Knochenmark von Brustkrebspatientinnen wurden sowohl gro\\xdfe Alterationen, die durch Metaphasen-CGH detektiert worden waren, als auch kleine zus\\xe4tzliche Aberrationen zwischen 3,5 und 4,7 Mb Gr\\xf6\\xdfe detektiert. Ausgew\\xe4hlte chromosomale Gewinne konnten durch eine qPCR unabh\\xe4ngig verifiziert werden. Der 3K BAC-Array erh\\xf6ht die Aufl\\xf6sung der Metaphasen-CGH um den Faktor 10-30 und ist au\\xdferdem publizierten Verfahren zur Array-CGH mit Einzelzellen \\xfcberlegen. Mit seiner Hilfe war eine hochaufl\\xf6sende Untersuchung gestreuter Methaphasen-CGH-negativer Tumorzellen m\\xf6glich, was zur Identifizierung bislang unerkannter Ver\\xe4nderungen f\\xfchrte. Die Einzelzell-Array-CGH-Technologie erm\\xf6glicht nun die Charakterisierung mikrometastatischer Vorl\\xe4uferzellen und damit neue Erkenntnisse \\xfcber fr\\xfche Stadien der Krebserkrankung.'