Untersuchungen zur Apoptose
b'Programmierter Zelltod oder Apoptose ist essentiell f\\xfcr die Entwicklung und Hom\\xf6ostase\\nmehrzelliger Organismen. St\\xf6rungen in der Regulierung dieser Prozesse k\\xf6nnen zu\\nzahlreichen Erkrankungen f\\xfchren, unter anderem zu Autoimmunerkrankungen und Krebs. In\\nden letzten Jahren konnte in zahlreichen Arbeiten gezeigt werden, da\\xdf Mitochondrien eine\\nwichtige Rolle bei der Steuerung der Apoptoseprozesse spielen. So wird Cytochrom c, ein\\nProtein aus dem mitochondrialen Intermembranraum, durch einen pro-apoptotischen Stimulus\\nals ein Caspase-Aktivierungsfaktor ins Cytosol freigesetzt.\\nIn der vorliegenden Arbeit wird die initiale Charakterisierung eines neuen murinen Proteins\\n(mDAP-3) beschrieben. mDAP-3 wurde identifiziert bei dem Versuch molekulare Marker der\\nNierenentwicklung mit Hilfe einer modifizierten \\u201edifferential display\\u201c Polymerase\\nKettenreaktion zu finden. Die 1,7 kb gro\\xdfe mDAP-3 mRNA kodiert f\\xfcr ein ca. 45 kDa gro\\xdfes\\nProtein, das als funktionelles Motiv eine ATP/GTP-Bindungsstelle (P-Loop) besitzt. Die\\nAnalyse der Aminos\\xe4urensequenz von mDAP-3 ergab eine 81 %ige Identit\\xe4t zu dem\\nhumanen DAP-3 (Death Associated Protein 3), einem positiven Apoptose Mediator.\\nNorthern-Blot-Analyse von 20 \\xb5g Gesamt-RNA aus 11 Organen adulter M\\xe4use zeigte eine\\nabundante mDAP-3 Expression in Niere, Herz, Leber, Thymus, Muskel, Milz, Darm und\\nBauch, mit einem Expressionsmaximum in Testis. Eine geringe bis fast fehlende Expression\\nkonnte in der Lunge und im Ovar gezeigt werden.\\nDie \\xdcberexpression eines mDAP-3/EGFP Fusionproteins in murinen Mesangialzellen\\n(MMC) f\\xfchrte zu einer Apoptoseinduktion bei 27,6% \\xb1 2,6% (n=3) der Zellen gegen\\xfcber\\neiner Apoptose Inzidenz von 11,9% \\xb1 2,8% bei MMCs die mit einem Kontrollvektor\\ntransfiziert wurden. Die pro-apoptotische Funktion von mDAP-3 ist dabei abh\\xe4ngig von der\\nFunktionalit\\xe4t des P-Loops. Die \\xdcberexpression eines P-Loop mutierten mDAP-3/EGFP\\nFusionproteins f\\xfchrte zu keiner Apoptoseinduktion. Sowohl das murine als auch das humane\\nDAP-3 bleiben w\\xe4hrend der Apoptose intra-mitochondrial und werden nicht in das Cytosol\\nfreigesetzt.\\nF\\xfcr die Untersuchung der intrazellul\\xe4ren Lokalisation von mDAP-3 wurde ebenfalls das\\nmDAP-3/EGFP-Fusionsprotein verwendet. Murine-Tubuluszellen (MTC) zeigten nach\\nTransfektion mit dem Fusionsprotein ein punktiertes Signal im Fluoreszenz-Mikroskop. Im\\nGegensatz dazu zeigten Zellen nach Transfektion mit dem EGFP-Expressionsvektor alleine\\ndas f\\xfcr EGFP typische diffuse, zytosolische Fluoreszenzsignal. Sowohl im Fluoreszenz-Mikroskop als auch im konfokalen Laser-Scann-Mikroskop lokalisierte mDAP-3/EGFP\\nzusammen mit einem mitochondrialen Farbstoff, jedoch nicht mit einem lysosomalen. Diese\\nErgebnisse weisen auf eine mitochondriale Lokalisation von mDAP-3 hin.\\nZellfraktionierungen best\\xe4tigten die mitochondriale Lokalisation von mDAP-3. Das endogene\\nmDAP-3 Protein konnte nur in der mitochondrialen Fraktion, nicht jedoch in der\\nendoplasmatischen Reticulum- oder der zytosolischen-Fraktion, nachgewiesen werden.\\nProteinase-K-Behandlung isolierter Mitochondrien f\\xfchrte zu keiner Reduktion der mDAP-3\\nProteinmenge im Western-Blot. Dies lie\\xdf auf eine intra-mitochondriale Lokalisation von\\nmDAP-3 schlie\\xdfen. Digitonin-Behandlung isolierter Mitochondrien zeigte eine Freisetzung\\nvon mDAP-3 aus den Mitochondrien bei relativ hohen Digitonin Konzentrationen (0,3%).\\nGanz im Gegensatz dazu wurde Cytochrom c bereits bei 0,075% Digitonin freigesetzt. Diese\\nDaten weisen auf eine mDAP-3 Lokalisation in der mitochondrialen Matrix hin.\\nDa die DAP-3 Proteinfamilie in Eukaryonten sehr konserviert ist und auch in nichtapoptotischen\\nOrganismen wie S. cerevisiae vertreten ist, mu\\xdf DAP-3 eine weitere Funktion\\nneben der pro-apoptotischen besitzen. Um die Rolle von DAP-3 n\\xe4her zu definieren wurde\\neine Disruption des mDAP-3 Hefe-Orthologs YGL129c (yDAP-3) durchgef\\xfchrt. Die yDAP-3\\nNullmutanten zeigten keinen Wachstumsverlust auf nicht fermentierbaren Kohlenstoffquellen\\nwie Glycerol oder Lactat. Dies deutet darauf hin, da\\xdf yDAP-3 f\\xfcr die mitochondriale Atmung\\nnicht zwingend notwendig ist. Allerdings zeigten Hefen bei einer yDAP-3 Disruption einen\\nsignifikanten und progressiven Verlust ihrer mitochondrialen DNA (mtDNA) (46% in\\n\\u2206yDAP-3 vs. 3% im Wildtyp). Dieser Verlust der mtDNA, der auf eine Funktion von yDAP-\\n3 f\\xfcr die mitochondriale Biogenese hinweist, lie\\xdf sich durch eine Transfektion der \\u2206yDAP-3\\nHefen mit dem murinen DAP-3 teilweise verhindern. Damit konnte bewiesen werden, da\\xdf die\\nFunktion, die DAP-3 f\\xfcr die Biogenese der Mitochondrien aus\\xfcbt, unter Eukaryonten\\nkonserviert ist.\\nDiese Daten identifizieren mDAP-3 als einen der ersten pro-apoptotischen Faktoren der\\nmitochondrialen Matrix. Weiterhin kann eine duale Funktion f\\xfcr die Mitglieder der DAP-3\\nProteinfamilie postuliert werden. Zum Einen spielen sie eine wichtige, evolution\\xe4r\\nkonservierte Rolle f\\xfcr die Biogenese von Mitochondrien, zum Anderen besitzen sie in\\nmehrzelligen Organismen eine zus\\xe4tzliche pro-apoptotische Funktion.'