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b'Plasma-Kallikrein (PK) ist eine Serinprotease, die als inaktives Zymogen Plasma-\\nProkallikrein (PPK) in der Leber gebildet und in den Blutstrom sezerniert wird. Dort erfolgt\\ndie Konvertierung zum aktiven Enzym im Kontaktphasen-System der Blutgerinnung. Neben\\nder Funktion im Kontakt-System spielt diese Protease sowohl in der Fibrinolyse als auch im\\nKallikrein-Kinin-System eine zentrale Rolle. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass PPKmRNA\\nauch au\\xdferhalb der Leber exprimiert wird. Daraus ist zu schlie\\xdfen, dass dort ebenfalls\\nPPK-Protein gebildet wird und dass diesem extrahepatischen, gewebest\\xe4ndigen PPK bzw. PK\\nspezielle lokale Funktionen zukommen. Dieser Befund bildet die Grundlage dieser\\nDissertation.\\nMit dem langfristigen Ziel die physiologische und pathophysiologische Rolle des extrahepatisch\\ngebildeten PPK aufzukl\\xe4ren, sollte in dieser Arbeit zun\\xe4chst mittels einer quantitativen\\nPCR-Technik (TaqMan) untersucht werden, in welchem Umfang PPK-mRNA und die\\nmRNAs der \\xfcbrigen Komponenten des Kontaktphasen-Systems in humanen Zellen bzw. Geweben\\nexprimiert werden. Aufgrund dieser Ergebnisse sollte im zweiten Teil der Arbeit untersucht\\nwerden, ob bzw. inwieweit das PPK-Gen gewebespezifisch reguliert werden kann.\\nHierzu sollten die regulatorisch bedeutsamen Regionen des PPK-Gens charakterisiert werden.\\nMittels der TaqMan-Technologie konnte die PPK-mRNA-Expression in allen untersuchten\\nhumanen Geweben quantifiziert werden. In neun Geweben liegt die mRNA-Expression im\\nVergleich zur Leber zwischen 1 % und 68 % und in sechs Geweben zwischen 0,1 % und 1 %.\\nDiese Ergebnisse sprechen f\\xfcr eine ubiquit\\xe4re, aber teils sehr unterschiedliche Expression der\\nPPK-mRNA in humanen Geweben.\\nDie mRNAs von hochmolekularem Kininogen (HK), niedermolekularem Kininogen (LK),\\nFaktor XI (FXI) und Faktor XII (FXII) werden dagegen nur in wenigen Geweben exprimiert.\\nDie Transkripte von HK, LK und FXI findet man au\\xdferhalb der Leber nur noch in Nierengewebe\\nin signifikanter Menge, w\\xe4hrend FXII-mRNA nahezu ausschlie\\xdflich in der Leber\\nsynthetisiert wird. Ein gemeinsames Merkmal aller Transkripte ist, dass sie in Lebergewebe\\nam st\\xe4rksten expimiert werden.\\nZellstimulationsversuche mit HepG2-Zellen ergaben, dass die PPK-mRNA-Synthese mittels\\nLipopolysacchariden (LPS) kurzfristig induziert werden kann, was f\\xfcr eine wesentliche\\nFunktion von PPK bzw. PK bei Entz\\xfcndungsreaktionen spricht. Im Gegensatz hierzu bewirkt\\nPhorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) eine Herabregulation der PPK-Transkription.\\nUntersuchungen zur Stabilit\\xe4t der mRNAs von PPK und dem Haushaltsgen GAPDH mit den\\nTranskriptionsinhibitoren Actinomycin D, \\u03b1-Amanitin und DRB zeigten, dass die mRNAAbbaurate\\nin HepG2-Zellen vom jeweils eingesetzten Transkriptionsinhibitor abh\\xe4ngt. Bei\\nallen Transkriptionsinhibitoren wurde das PPK-Transkript im Vergleich zu GAPDH deutlich\\nschneller (Faktor 3-5) abgebaut. Dies weist darauf hin, dass die PPK-mRNA-Spiegel in den\\nZellen durch st\\xe4ndige Neusynthese aufrechterhalten werden, um eine kontinuierliche Produktion\\nvon PPK zu gew\\xe4hrleisten.\\nMittels der RLM-RACE Methode wurden in Leber-, Pankreas-, Nieren- und Testisgewebe die\\nPPK-Transkriptionsstartpunkte (TS) identifiziert. W\\xe4hrend in der Leber und im Pankreas nur\\nTSs in Exon 1 des PPK-Gens benutzt werden, findet man in Nieren- und Testisgewebe TSs\\nsowohl in der upstream-Region als auch in Intron 1. Weiterhin wurden in Nierengewebe drei\\nam 5\\xb4-Ende verk\\xfcrzte PPK-Transkripte detektiert, die aufgrund dieser Deletion keine Signalpeptid-\\nSequenz enthalten und dadurch eine intrazellul\\xe4re Lokalisation der entsprechenden\\nPPK-Isoform bedingen. Die Consensussequenz-Analyse f\\xfcr die Transkriptionsinitiation zeigt,\\ndass jedem experimentell ermittelten Transkriptionsstart eine TATA-Box oder/und ein\\nInitiator-Element assoziiert ist. Au\\xdferdem konnte durch die RLM-RACE-Analysen die Existenz\\neines weiteren untranslatierten Exons im 5\\xb4-Bereich des PPK-Gens ausgeschlossen werden.\\nUnter Anwendung der Genome Walker Technik wurde die Promotorregion (P-1729) stromaufw\\xe4rts\\nvon Exon 1 kloniert und mittels Reportergen-Studien analysiert. In HepG2-Zellen\\nzeigt dieses Gensegment eindeutig transkriptionsaktivierende Kapazit\\xe4t.\\nDurch die Generierung von neun Verk\\xfcrzungsvarianten konnten der Core-Promotor (-158 bis\\n+22), Enhancerbereiche (-1675 bis -1494) und Silencerregionen (-1304 bis -674) charakterisiert\\nwerden. Die Transkriptionsfaktoren-Analyse ergab, dass bei der Regulation durch die\\nP-1729 Region neben ubiquit\\xe4r exprimierten auch streng gewebespezifische Transkriptionsfaktoren\\neine zentrale Rolle spielen.\\nReportergen-Untersuchungen des Intron-1-Bereichs in HEK 293-Zellen zeigten, dass auch\\ndiese Region des PPK-Gens transkriptionsaktivierende Kapazit\\xe4t besitzt. Ebenso zeigt aber\\nauch der P-1729 Bereich in HEK 293-Zellen Promotoraktivit\\xe4t. Somit k\\xf6nnen innerhalb eines\\nZelltyps beide Promotorbereiche funktionell aktiv sein, wodurch eine alternative Regulation\\nder PPK-Transkription erm\\xf6glicht wird.'