Identifizierung und Charakterisierung von Proteasen der Photosynthesemembran
b'Die vorliegende Arbeit besch\\xe4ftigt sich mit dem proteolytischen System des Chloroplasten\\nh\\xf6herer Pflanzen und hier speziell mit dem des Thylakoidsystems. Vorderstes Ziel war die\\nIsolierung und Charakterisierung neuer, bislang unbekannter Komponenten. Zu diesem\\nZweck wurden zwei unterschiedliche Ans\\xe4tze erprobt: Einmal der rein biochemische Weg,\\nbei dem der Versuch unternommen wurde, speziell lichtinduzierte proteolytische Aktivit\\xe4ten\\ndes Thylakoidlumens nachzuweisen, anzureichern, und, falls m\\xf6glich, aufzureinigen. Mit dem\\nzweiten Ansatz wurde zun\\xe4chst versucht, in Sequenzvergleichen auf molekularbiologischer\\nEbene homologe Gene zu bekannten bakteriellen und cyanobakteriellen Proteasen im pflanzlichen\\nGenom ausfindig zu machen, und ausgehend von diesen dann die zugeh\\xf6rigen Genprodukte\\nzu isolieren und charakterisieren.\\n1. Nachweis, Charakterisierung und Aufreinigung lichtstre\\xdfinduzierter Proteasen des Thylakoidlumens:\\nDie zu diesem Ansatz durchgef\\xfchrten Experimente konnten im Thylakoidlumen\\nvon Erbsenchloroplasten durch den Einsatz von Aktivit\\xe4tstests auf substrathaltigen Polyacrylamidgelen\\nmindestens f\\xfcnf distinkte proteolytische Aktivit\\xe4ten sichtbar machen. Diese Aktivit\\xe4ten\\nerwiesen sich als eindeutig induzierbar durch Hochlicht. Sie wurden jedoch s\\xe4mtlich\\ndurch in \\xe4u\\xdferst geringer Menge vorliegende Komponenten des Lumens hervorgerufen. An\\nder dadurch, sowie zus\\xe4tzlich durch einen Lichtadaptationseffekt des Pflanzenmaterials, bedingten\\nschlechten Reproduzierbarkeit der Aktivit\\xe4ten scheiterten schlie\\xdflich sowohl die Charakterisierung\\nder unbekannten Proteasen als auch deren weitere Aufreinigung. Die Arbeiten\\nsind dennoch dazu angetan, eine Vorstellung von der Gr\\xf6\\xdfe und Komplexit\\xe4t des proteolytischen\\nSystems alleine des Thylakoidlumens zu vermitteln.\\n2. Klonierung der Gene neuer plastid\\xe4rer Proteasen und Charakterisierung der zugeh\\xf6rigen\\nGenprodukte: Im Rahmen der Arbeit wurden die Gene zweier zuvor nicht beschriebener\\nmutma\\xdflicher Proteasen aus Arabidopsis thaliana L. isoliert, beides Homologe zu bekannten\\nProteasen aus E. coli.\\nhhoA: Das Produkt dieses Gens stellt ein Mitglied der ubiquit\\xe4r verbreiteten HtrA-Familie\\nvon Serinproteasen dar, deren Zahl sich in Arabidopsis auf mittlerweile vierzehn bel\\xe4uft. Es\\nbesitzt die typische katalytische Triade der Familie, l\\xe4\\xdft jedoch die zumindest f\\xfcr die meisten\\ncharakterisierten Homologe typische sogenannte PDZ-Dom\\xe4ne im N-terminalen Bereich\\nvermissen. In den Experimenten zur Kartierung des Gens konnte gezeigt werden, da\\xdf dieses\\nin singul\\xe4rer Kopienzahl auf Chromosom IV lokalisiert ist. Anschlie\\xdfende Untersuchungen zur Expression konnten in Pflanzen jedoch weder unter normalen Anzuchtsbedingungen,\\nnoch nach Stre\\xdfexperimenten mit Hochlicht und Hitzestre\\xdf ein spezifisches Transkript nachweisen.\\nIn vitro-Experimente belegten die Transkribier- und Translatierbarkeit des Gens; dessen\\nProdukt im in organello-Importexperiment als l\\xf6sliche Komponente im Thylakoidlumen\\nakkumulierte. Weitere Untersuchungen an Chloroplastenfraktionen aus Spinat und Arabidopsis\\nunter Zuhilfenahme eines gegen das heterolog exprimierte gereifte Genprodukt produzierten\\npolyklonalen Antik\\xf6rpers bewiesen, da\\xdf hhoA auch in vivo synthetisiert wird und wie im\\nImportexperiment im Thylakoidlumen lokalisiert ist. Verschiedene Versuche zur Funktion des\\nProteins brachten kein eindeutiges Ergebnis. Die Transformation von Arabidopsis mit Sinnund\\nGegensinnkonstrukten des Gens war zwar erfolgreich, erzeugte jedoch Pflanzen ohne\\nerkennbar vom Wildtyp abweichenden Ph\\xe4notyp.\\nsppA: Das Homolog zu der Signalpeptid-prozessierenden Protease aus E. coli, Protease IV,\\nstellt das bislang einzige beschriebene in h\\xf6heren Pflanzen dar. Das Gen ist, wie in Experimenten\\nzu seiner Kartierung gezeigt wurde, in singul\\xe4rer Kopienzahl im Genom vorhanden,\\nlokalisiert auf Chromosom I. In Untersuchungen zur Expression konnte das Transkript unter\\nnormalen Anzuchtsbedingungen nicht nachgewiesen werden. Bei Behandeln der Pflanzen mit\\nLichtstre\\xdf \\xfcber l\\xe4ngere Zeit wurde jedoch ein nach mehrst\\xfcndiger Latenzzeit einsetzendes\\nAnsteigen der Transkriptrate beobachtet. Das Genprodukt wurde nach in vitro-Transkription\\nund -Translation im in organello-Importexperiment als peripher mit der stromalen Oberfl\\xe4che\\nder Thylakoidmembran assoziiert charakterisiert. Untersuchungen an Chloroplastenfraktionen\\nmittels Antik\\xf6rpern, die gegen den C-Terminus des heterolog exprimierten SppA-Proteins\\nproduziert worden waren, best\\xe4tigten neben dem Nachweis des Vorhandenseins auch unter\\nNormalbedingungen diese Lokalisation auch in vivo. Bei weiterer Subfraktionierung der\\nThylakoide fand sich das Protein vornehmlich assoziiert mit Stromathylakoiden. Die bei Bestrahlung\\nder Pflanzen mit hohen Lichtintensit\\xe4ten steigende Expressionsrate deutet auf eine\\nfunktionelle Neudefinierung von SppA in photosynthesetreibenden Organismen im Vergleich\\nzu E. coli und auf eine Rolle innerhalb der langfristigen Adaptationsmechanismen der Pflanze\\ngegen Lichtstre\\xdf hin. Weitere Untersuchungen konnten jedoch keine eindeutigen Hinweise\\nbez\\xfcglich der spezifischen Funktion des Proteins liefern.'