Identifikation und Charakterisierung von neuen Interaktionspartnern des CDK-Inhibitors p27Kip1
b'Der eukaryontische Zellzyklus wird durch die Aktivit\\xe4t verschiedener Cyclinabh\\xe4ngiger\\nKinasen (CDKs) reguliert. Die zellul\\xe4re Menge des CDK-Inhibitorproteins\\np27Kip1 spielt eine entscheidende Rolle beim \\xdcbergang der Zelle von der G1- zur SPhase.\\nDie Menge von p27Kip1 steigt w\\xe4hrend der G0- oder der G1-Phase an und nimmt\\nzu Beginn der S-Phase rasch wieder ab. Die Bindung von p27Kip1 an die CDKKomplexe\\nder G1-Phase inaktiviert diese und verhindert dadurch die Initiation der SPhase.\\nEine verminderte Menge von p27Kip1 am G1/S-Phase\\xfcbergang findet man\\ndagegen h\\xe4ufig in verschiedenen Tumorgeweben. Die geringere zellul\\xe4re Menge des\\nInhibitors ist dabei mit einer hohen Patientensterblichkeit und einem aggressiven\\nVerlauf der Erkrankung verbunden.\\nDie zellul\\xe4re Aktivit\\xe4t und Menge von p27Kip1 wird entscheidend durch Proteine\\nreguliert, die mit p27Kip1 interagieren. In dieser Arbeit wurden deshalb mit Hilfe von\\nrekombinantem p27Kip1 Interaktionspartner des Inhibitors in HeLa-Zellextrakt\\nidentifiziert.\\nEs konnte gezeigt werden, da\\xdf p27Kip1 an die CDK-Proteine und an Grb2 bindet. Grb2\\nist ein Adapterprotein der Signaltransduktion. Die Interaktion zwischen p27Kip1 und\\nGrb2 k\\xf6nnte damit, nach Stimulation der Zelle durch verschiedene Mitogene, die\\nSignalweitergabe mit der Zellzyklusmaschinerie verbinden. Die zu dieser Interaktion\\nnotwendige Dom\\xe4ne in p27Kip1 konnte in weiteren Analysen auf eine acht Aminos\\xe4uren\\nlange Prolin-reiche Region eingegrenzt werden. Auf der anderen Seite interagiert Grb2\\nvornehmlich \\xfcber seine C-terminale SH3-Dom\\xe4ne mit p27Kip1. Die beiden mit p27Kip1\\nnah verwandten Inhibitorproteine p21Cip1 und p57Kip2 interagieren dagegen nicht mit\\nGrb2.\\nIn einer erweiterten Analyse wurden 41 verschiedene rekombinante SH3-Dom\\xe4nen auf\\neine Interaktion mit p27Kip1 hin getestet. Es konnte gezeigt werden, da\\xdf p27Kip1 nur mit\\nder C-terminalen SH3-Dom\\xe4ne von Grf40/Mona und der SH3-Dom\\xe4ne der\\nTyrosinkinase Lyn wechselwirkt. Die Interaktion der Tyrosinkinase Lyn in vivo f\\xfchrte\\nzur Hypothese, da\\xdf p27Kip1 durch Lyn phosphoryliert werden k\\xf6nnte. Im zweiten Teil\\ndieser Arbeit wurde deshalb die Tyrosinphosphorylierung von p27Kip1 untersucht.\\nIn Phosphoaminos\\xe4ureanalysen mit metabolisch markierten Zellen konnte gezeigt\\nwerden, da\\xdf p27K i p 1 in vivo an Tyrosinresten phosphoryliert wird. Diese\\nZusammenfassung 13\\nPhosphorylierung konnte durch rekombinant hergestellte Tyrosinkinasen und\\nverschiedene Tyrosin/Phenylalanin-Austausche in p27Kip1 auf Tyrosin 88 und 89\\neingegrenzt werden. Nach Kristallstrukturdaten des trimeren Komplexes aus p27Kip1,\\nCDK2 und Cyclin A kommt der Tyrosinrest 88 von p27Kip1 in der ATP-Bindetasche der\\nKinase zu liegen und blockiert diese. Es wurde deshalb untersucht, inwieweit eine\\nPhosphorylierung von p27Kip1 an Tyrosin 88 oder 89 Einflu\\xdf auf die Aktivit\\xe4t des\\nInhibitors hat. Die Tyrosinphosphorylierung von p27Kip1 verhindert nicht die Bindung\\nan den CDK-Komplex. Allerdings konnte mit in vitro-phosphoryliertem p27Kip1 gezeigt\\nwerden, da\\xdf eine Tyrosinphosphorylierung zu einer etwa 40%-igen Reduktion der\\nAktivit\\xe4t des Inhibitors f\\xfchrt. Diese Ergebnis konnte in vivo best\\xe4tigt werden.\\nInteressanterweise verst\\xe4rkt die Tyrosinphosphorylierung des Inhibitors die\\nPhosphorylierung von p27Kip1 an Threonin 187 durch den gebundenen CDK-Komplex.\\nDie Phosphorylierung von p27Kip1 an Threonin 187 ist in der Zelle ein initiales Signal\\nzum Abbau von p27Kip1 durch das 26S-Proteasom. Das so markierte p27Kip1 wird von\\neinem E3-Ligase-Komplex erkannt und ubiquitiniert. Es wurde deshalb untersucht,\\nwelchen Einflu\\xdf die Tyrosinphosphorylierung auf den Abbau von p27Kip1 besitzt. In\\nHalbwertszeitbestimmungen mit einer SH3-bindedefizienten Form von p27Kip1 und\\neiner Tyrosin/Phenylalanin-Austauschform von p27Kip1 konnte zeigten werden, da\\xdf\\nbeide Formen, im Vergleich zu unver\\xe4ndertem p27Kip1, eine h\\xf6here Stabilit\\xe4t aufweisen.\\nDie Interaktion von p27Kip1 mit der Tyrosinkinase Lyn und die Inaktivierung des\\nInhibitors durch die Phosphorylierung von Tyrosinresten zeigt eine M\\xf6glichkeit auf wie\\np27Kip1, in Abh\\xe4ngigkeit von mitogenen Stimuli, reguliert werden kann. Die in dieser\\nArbeit gefundene Interaktion von Grb2, Grf40 und Lyn mit p27Kip1 verbindet damit die\\nSignaltransduktion mit der Zellzykluskontrolle.'