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b'Die an der Synthese von acylierten Flavonolglykosiden, den UV-B-Schutzpigmenten in der\\nKiefer und anderen B\\xe4umen, beteiligten Hydroxycinnamoyl-Transferasen sind weitgehend\\nunerforscht. Dies verwundert um so mehr, als Kenntnisse \\xfcber den UV-B-Schutz bei B\\xe4umen,\\ndie von gro\\xdfer \\xf6kologischer und \\xf6konomischer Bedeutung sind, unter dem Eindruck\\nsinkender stratosph\\xe4rischer Ozonwerte und der damit prognostizierten erh\\xf6hten UV-B-Belastung\\nauch in mittleren Breiten sehr wichtig geworden sind. Andererseits haben Untersuchungen\\nzu Hydroxycinnamoyl-Transferasen, die an der Synthese von Bl\\xfctenfarbstoffen\\n(acylierte Anthocyane) und Phytoalexinen (acylierte Amine) beteiligt sind, in den letzten\\nJahren einige Fortschritte erbracht. In der vorliegenden Arbeit wird versucht, mit proteinbiochemischen\\nund \\xf6kophysiologischen Untersuchungen zu Hydroxycinnamoyl-Transferasen,\\ndie Flavonolglykoside acylieren, hier eine L\\xfccke zu schlie\\xdfen.\\nDie Untersuchungen zu den Hydroxycinnamoyl-Transferasen lassen sich in drei Teile gliedern:\\n(i) einen methodischen Teil, in dem mit der Entwicklung eines Enzymtests die Grundlagen\\nf\\xfcr die beiden folgenden Teile erarbeitet wurden; (ii) ein physiologisch-\\xf6kologischer Teil,\\nin dem Messungen von Enzymaktivit\\xe4ten und Inhaltsstoffgehalten in Nadeln adulter B\\xe4ume\\nim Freiland und von Keimlingen unter kontrollierten Bedingungen in Sonnensimulatoren vorgenommen\\nwurden; (iii) ein proteinbiochemischer Teil, der eine Charakterisierung der\\nEnyzme und die Reinigung der 3\\u2019\\u2019-HCT beinhaltet.\\n(i) F\\xfcr den Nachweis und die Quantifizierung der Aktivit\\xe4t der Hydroxycinnamyoltransferasen\\nin Extrakten von Kiefernnadeln wurde ein Enzymtest entwickelt. Daf\\xfcr wurde die\\nAufschlusstechnik und die HPLC-Methode, mit der die Enzymprodukte analysiert wurden,\\noptimiert. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass in der Kiefer drei verschiedene f\\xfcr die\\nGlucose der Flavonolglykoside positionsspezifische Transferasen vorhanden sind. Von den\\nProdukten dieser Enzyme konnten die Acylierungspositionen aufgekl\\xe4rt werden, wobei sich\\nherausstellte, dass die 3\\u2019\\u2019- und der 6\\u2019\\u2019-HCT an der Synthese der UV-B-Schutzpigmente\\nbeteiligt sind, w\\xe4hrend die Produkte der 4\\u2019\\u2019-HCT in der Kiefer noch nicht bekannt sind.\\n(ii) In Sonnensimulatorexperimenten mit Kiefernkeimlingen konnte gezeigt werden, dass die\\nAktivit\\xe4t der 6\\u2019\\u2019-HCT durch UV-B induziert wurde, w\\xe4hrend die Aktivit\\xe4t der 3\\u2019\\u2019-HCT konstitutiv\\nvorlag und durch UV-B nicht beeinflusst wurde. In den Freilandb\\xe4umen zeigte sich,\\ndass die 6\\u2019\\u2019-HCT entwicklungspezifisch aktiv war, w\\xe4hrend die Aktivit\\xe4t der 3\\u2019\\u2019-HCT auch hier konstitutiv vorlag. Die Akkumulation der diacylierten Flavonol 3-glykoside konnte nur\\nzu Beginn der Nadelentwicklung beobachtet werden und korrelierte mit der Aktivit\\xe4t der 6\\u2019\\u2019-\\nHCT, woraus geschlossen werden kann, dass die 6\\u2019\\u2019-HCT die Synthese der UV-B-Schutzpigmente\\nreguliert, w\\xe4hrend die Rolle der 3\\u2019\\u2019-HCT unklar bleibt, da keine Akkumulation von\\nmonoacylierten Flavonolglykosiden beobachtet wurde.\\nDie schnelle Akkumulation und nachfolgende Abnahme der diacylierten Verbindungen\\nzeigen, dass diese Verbindungen f\\xfcr den UV-B-Schutz in den besonders gef\\xe4hrdeten jungen\\nNadeln verantwortlich sind. In \\xe4lteren Nadeln sind andere langfristige Schutzmechanismen\\nvorhanden, wobei vor allem zellwandgebundene Flavonoide und Hydroxyzimts\\xe4uren in Frage\\nkommen, da diese langsamer akkumulieren als die l\\xf6slichen diacylierten Verbindungen.\\nDer Vergleich der Keimlingsexperimente mit den Freilanduntersuchungen zeigt, dass die\\nPrim\\xe4rnadeln der Keimlinge ein gutes Modell f\\xfcr sich entwickelnde Nadeln von adulten\\nFreilandb\\xe4umen darstellen, da sie sich physiologisch vergleichbar verhalten. Die Keimlinge\\nbesitzen einige Vorteile gegen\\xfcber mehrj\\xe4hrigen B\\xe4umen, da sie jederzeit verf\\xfcgbar und in\\ngr\\xf6\\xdferer Individuenzahl untersucht werden k\\xf6nnen.\\n(iii) Mit teilweise gereinigten Enzymen konnte gezeigt werden, dass die Acylierung der\\nFlavonolglykoside in einer festen Reihenfolge abl\\xe4uft. Die Synthese der UV-B-Schutzpigmente\\nerfolgt durch die Acylierung zuerst an 6\\u2019\\u2019-Position und dann an 3\\u2019\\u2019-Position.\\nF\\xfcr die 3\\u2019\\u2019- und die 4\\u2019\\u2019-HCT wurde ein apparentes Molekulargewicht von 45 bzw. 35 kDa\\nund ein pI-Wert von 4.7 ermittelt. Diese Werte liegen in einem Bereich, der ebenso f\\xfcr HCT\\u2019s\\naus verschiedenen Pflanzen, die andere Substrate acylieren, festgestellt wurde. F\\xfcr die 6\\u2019\\u2019-\\nHCT wurde dagegen ein au\\xdferordentlich geringes apparentes Molekulargewicht von 9 kDa\\nund ein relativ hoher pI-Wert von 7.7 bis 7.9 ermittelt. Weitere Untersuchungen sind n\\xf6tig,\\num festzustellen, ob es sich dabei um eine proteolytische Spaltung des Enzyms handelt.\\nAlle drei Transferasen zeigten gegen\\xfcber dem Akzeptorsubstrat eine hohe Spezifit\\xe4t f\\xfcr\\ndas Flavonolaglykon, wobei die Aktivit\\xe4t der 6\\u2019\\u2019-HCT bei gr\\xf6\\xdferer Polarit\\xe4t an 3\\u2019-Position\\n(Quercetin) h\\xf6her war, die der 3\\u2019\\u2019-HCT bei geringerer Polarit\\xe4t an dieser Position (K\\xe4mpferol\\nund Isorhamnetin). \\xc4hnlich hoch ist auch die Spezifit\\xe4t gegen\\xfcber dem Zuckerrest des\\nAkzeptorsubstrats. Die h\\xf6chste Aktivit\\xe4t wurde mit dem Glukosid festgestellt, das bisher auch\\nnur in der Kiefer nachgewiesen wurde.\\nDie Spezifit\\xe4t gegen\\xfcber dem Donorsubstrat zeigt zum einen eine Abh\\xe4ngigkeit von CoAEster,\\nda keine Aktivit\\xe4t mit Glukose-Estern gemessen werden konnte. Zum anderen ist der\\naromatische Charakter des Donorsubstrats von entscheidender Bedeutung, da sowohl die CoA-Ester verschiedener Hydroxyzimts\\xe4uren als auch Benzoyl-CoA als Substrate verwendet\\nwerden. Aliphatische CoA-Ester wie Acetyl- oder Malonyl-CoA werden von den HCT\\u2019s nicht\\nals Substrate akzeptiert.\\nMit einer analytischen Reinigung der 3\\u2019\\u2019-HCT, die s\\xe4ulenchromatographische Schritte\\nbeinhaltete, wurden in sechs Schritten zwei Protein-Banden mit einer Gr\\xf6\\xdfe von 24 und\\n28 kDa isoliert, die mit der Enzymaktivit\\xe4t korrelierten. Mit einer pr\\xe4parativen Reinigung mit\\nnativer Elektrophorese konnten diese beiden Banden in ausreichender Menge erhalten\\nwerden, sodass eine Sequenzierung von Peptiden m\\xf6glich war. Ein Vergleich der Aminos\\xe4uresequenzen\\nmit den in Datenbanken vorhandenen Sequenzen zeigte, dass es sich um zwei\\nunbekannte Peptide handelt.\\nDie Resultate der Reinigung bilden die Grundlage f\\xfcr molekularbiologische Arbeiten, mit\\ndenen es m\\xf6glich sein sollte, enzymspezifische Klone f\\xfcr die 3\\u2019\\u2019-HCT und, falls die Enzyme\\nauf Sequenzebene verwandt sind, auch f\\xfcr die 6\\u2019\\u2019-HCT herzustellen. Damit k\\xf6nnte zum\\nersten Mal die Sequenz einer Flavonol 3-glukosid-Hydroxycinnamoyl-Transferase aufgekl\\xe4rt\\nwerden. Mit Hilfe von molekularen Sonden lie\\xdfen sich die vermutete epidermale Lokalisierung\\nder Enzyme \\xfcberpr\\xfcfen und UV-B-Induktionskinetiken auf Ebene der mRNA\\ndurchf\\xfchren. Dabei w\\xe4ren vor allem Experimente mit UV-B-Intensit\\xe4ten sinnvoll, mit denen\\ndie obere Grenze der Anpassungsf\\xe4higkeit der Kiefer definiert werden kann.'