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b'Ziel dieser Arbeit war es ein serologisches Testystem f\\xfcr die Beantwortung \\xf6kologischer\\nFragestellungen zur Denitrifikation zu etablieren. F\\xfcr den in situ-Nachweis der Expression des\\ndenitrifizierenden Enzymsystems in Bakterien wurden spezifische monoklonale Antik\\xf6rper\\ngegen die Cu-haltige dissimilatorische Nitritreduktase (Cu-dNIR) entwickelt.\\nDie f\\xfcr die Produktion der Antik\\xf6rper ben\\xf6tigte Cu-dNIR wurde mit Hilfe zweier Ans\\xe4tze\\npr\\xe4pariert. Der erste Ansatz, die Kombination verschiedener S\\xe4ulenchromatografien und\\nReinigung \\xfcber eine Polyacrylamid-Matrix, erlaubte das Enzym aus einem Bodenisolat von\\nOchrobactrum anthropi mit einer Ausbeute von 2,5 \\xb5g/g Zellen (Feuchtgewicht) zu gewinnen.\\nIn einem zweiten Ansatz wurde die Cu-dNIR aus Alcaligenes faecalis S6 nach Fusion mit\\neinem 6 x His-tag in E. coli exprimiert und anschlie\\xdfend \\xfcber eine spezifische Affinit\\xe4tsmatrix\\naufgereinigt. Hiermit konnte eine Ausbeute von 4,5 mg/l [2,25 mg/g Zellen (Feuchtgewicht)]\\nBakterienkultur gewonnen werden.\\nMit der Cu-dNIR der beiden Pr\\xe4parationsans\\xe4tze wurden M\\xe4use immunisiert und nach drei\\nZellfusionen 41 verschiedene Hybridomalinien etabliert, deren sezernierte Antik\\xf6rper in einem\\nersten Screening im Chemolumineszenz-ELISA mit der f\\xfcr die Immunisierung benutzten CudNIR\\nreagierten. Hieraus wurden \\xfcber weitere Screeningschritte im Western-Blot zwei\\nAntik\\xf6rper zur genaueren Charakterisierung ausgew\\xe4hlt: Ein sehr spezifischer Antik\\xf6rper\\n(mAkdNIR1a), der ausschlie\\xdflich die zur Immunisierung eingesetzte Cu-dNIR aus\\nOchrobactrum anthropi 1a erkennt; und ein zweiter Antik\\xf6rper (mAkdNIR29) mit einem\\nbreiteren Reaktionsspektrum f\\xfcr Cu-dNIRs aus Bakterien unterschiedlicher phylogenetischer\\nHerkunft. Beide Antik\\xf6rper zeigten keine Kreuzreaktionen mit alternativen dissimilatorischen\\nNitritreduktasen des cd1-bzw. Siroh\\xe4m-Typs aus Pseudomonas aeruginosa bzw. E. coli. Die im\\nChemolumineszenz-ELISA bestimmte Sensitivit\\xe4t f\\xfcr mAkdNIR1a liegt bei 2 ng Cu-dNIR. Mit\\nmAkdNIR29 konnte rekombinante Cu-dNIR bis 5 ng nachgewiesen werden.\\nMit dem Antik\\xf6rper mAkdNIR29 konnte eine Differenzierung zwischen Reinkulturen von\\nAlcaligenes faecalis S6, die unter denitrifizierenden bzw. nicht denitrifizierenden Bedingungen\\ngewachsen waren, im Western Blot gezeigt werden. Weiterhin wurde der zeitliche Verlauf der\\nExpression von Cu-dNIR in Ochrobactrum anthropi nach Shift vom aeroben in anaerobes\\nMilieu mittels Immunofluoreszenz mit makdNIR29 auf Einzelzellniveau verfolgt. Das\\nMaximum der Expression wurde nach 7 h erreicht. Der Verlauf der Expressionsst\\xe4rke folgt der\\nZunahme der N2O-Produktion pro Zeiteinheit bezogen auf die Zellzahl. Die Expressionsrate der\\nCu-dNIR ist am st\\xe4rksten w\\xe4hrend der exponentiellen Wachstumsphase.\\nDie beiden anti-dNIR-Antik\\xf6rper konnten in Kombination mit Epifluoreszenz-und Laserscanning-\\nMikroskopie erfolgreich zur in situ-Detektion der Expression von Cu-dNIR durch\\nImmunofluoreszenz in Reinkulturen und Umweltproben eingesetzt werden. Der Antik\\xf6rper\\nmAkdNIR1a wurde wegen seiner Spezifit\\xe4t zum Nachweis von Cu-dNIR-induzierten Bakterien\\nan Wurzeln von Weizenpfl\\xe4nzchen eingesetzt, die zuvor mit Ochrobactrum anthropi inokuliert\\nworden waren. Mit dem Antik\\xf6rper mAkdNIR29 wurden Cu-dNIR-induzierte Bakterien in\\nKl\\xe4rschlammproben aus zwei verschiedenen Kl\\xe4ranlagen detektiert. Ein Protokoll zur\\nsimultanen Markierung von denitrifizierenden Zellen von Ochrobactrum anthropi 1a mit dem\\nAntik\\xf6rper mAkdNIR1a und einer rRNS-gerichteten Oligonukleotidsonde wurde entwickelt.\\nImmunofluoreszenzmarkierungen mit mAkdNIR29 erm\\xf6glichten die Trennung von Cu-dNIRinduzierten\\nund Cu-dNIR-nicht-induzierten Zellen von O. anthropi mittels Durchflusszytometrie\\nin zwei klar abgegrenzte Populationen.'