Expression und immunmodulatorische Funktion von HLA-G und seinen verkurzten Isoformen in Tumorzellinien
b'Das nicht polymorphe HLA-Klasse-I-Antigen HLA-G wird haupts\\xe4chlich in der Plazenta exprimiert, wo es vermutlich den semiallogenen F\\xf6tus vor Angriff des m\\xfctterlichen Immunsystems sch\\xfctzt. Eine Besonderheit von HLA-G ist das Auftreten von mehreren verk\\xfcrzten Isoformen, die von alternativ gesplei\\xdften Transkripten translatiert werden. Neben dem kompletten membranst\\xe4ndigen HLA-G1 mit den extrazellul\\xe4ren Dom\\xe4nen a1, a2 und a3 existieren die verk\\xfcrzten Isoformen HLA-G2 (\\u2206a2), HLA-G3 (\\u2206a2, \\u2206a3) und HLA-G4 (\\u2206a3). Au\\xdferdem wurden die l\\xf6slichen Isoformen HLA-G5 (HLA-G1s), HLA-G6 (HLA-G2s, \\u2206a2) und HLA-G7 (HLA-G3s, \\u2206a2, \\u2206a3) beschrieben.\\n\\nUm die Expression und Funktion einzelner Isoformen getrennt voneinander und ohne Beeinflussung durch andere MHC-Klasse-I-Molek\\xfcle untersuchen zu k\\xf6nnen, wurden Transfektanten f\\xfcr die Isoformen HLA-G1, HLA-G2, HLA-G4 und HLA-G5 in der HLA-Klasse-I-negativen humanen Zellinie K-562 generiert. HLA-G kann mit inhibitorischen und aktivierenden Rezeptoren auf NK- und T-Zellen in Wechselwirkung treten und so Effektorfunktionen beeinflussen. Die Expression von HLA-G kann au\\xdferdem indirekt \\xfcber HLA-E auf die Zytotoxizit\\xe4t von NK-Zellen und T-Zellen einwirken. Die HLA-E-Expression ist abh\\xe4ngig von Peptiden aus den Signalsequenzen von HLA-Klasse-I-schweren Ketten. Zum Ausschlu\\xdf der Koexpression des HLA-Klasse-I-Antigens HLA-E auf der Zelloberfl\\xe4che wurden HLA-G1mut- und HLA-G4mut-cDNA-Vektoren eingesetzt, deren Exon 1 so ver\\xe4ndert ist, da\\xdf kein Ligand f\\xfcr HLA-E zur Verf\\xfcgung gestellt wird.\\n\\nW\\xe4hrend in der Zellinie K-562 HLA-G1 und HLA-G5 auf der Zelloberfl\\xe4che exprimiert bzw. sezerniert werden, waren die verk\\xfcrzten Isoformen HLA-G2 und HLA-G4 mittels FACS-Analyse mit einer Reihe HLA-Klasse-I- und HLA-G-spezifischer Ak nicht auf der Zelloberfl\\xe4che nachweisbar. Diese Ergebnisse korrelieren mit der Sensitivit\\xe4t dieser verk\\xfcrzten Isoformen gegen\\xfcber Endo H. Aus der fehlenden Resistenz der HLA-G2- und HLA-G4-Polypeptide gegen\\xfcber Endo H ergibt sich kein Hinweis auf ihren Transport zur Zelloberfl\\xe4che. Diese fehlende Oberfl\\xe4chenexpression von HLA-G2 und HLA-G4 k\\xf6nnte auf einer gest\\xf6rten Assoziation mit b2m oder Bestandteilen der MHC-Klasse-I-Prozessierungsmaschinerie beruhen. Kopr\\xe4zipitationsexperimente ergaben, da\\xdf nur die HLA-G1-schwere Kette mit b2m und TAP assoziiert ist. HLA-G2 lie\\xdf sich zwar mit TAP, jedoch nicht mit b2m kopr\\xe4zipitieren und HLA-G4 lie\\xdf sich weder in Assoziation mit b2m noch mit TAP nachweisen, so da\\xdf diesen Isoformen ein wichtiger Bestandteil der vollst\\xe4ndigen HLA-I-Komplexe fehlt und bei HLA-G4 au\\xdferdem die Beladung mit Peptiden gest\\xf6rt ist. Diese Daten sprechen gegen eine Zelloberfl\\xe4chenexpression der verk\\xfcrzten HLA-G-Isoformen. Im Unterschied zu HLA-G1 war HLA-G5 nicht in Kopr\\xe4zipitaten mit TAP zu finden. Daher scheint f\\xfcr diese Isoform eine stabile Assoziation mit TAP f\\xfcr die Peptidbeladung nicht essentiell zu sein.\\n\\nZum funktionellen Nachweis von HLA-G wurden Zytotoxizit\\xe4tstests mit der Zellinie NKL sowie mit PBL, NK-Zellen und LAK-Zellen aus dem peripheren Blut mehrerer Donoren durchgef\\xfchrt. Dabei zeigte sich, da\\xdf die Expression der verk\\xfcrzten Isoformen HLA-G2 und HLA-G4 die Zytotoxizit\\xe4t der verschiedenen Effektorzellen nicht beeinflu\\xdfte. HLA-G1 inhibierte die Lyse von K-562 in Abh\\xe4ngigkeit von der HLA-G1-Expressionsst\\xe4rke und wirkte sich weniger deutlich als eine entsprechende HLA-E-Expression auf die Zytotoxizit\\xe4t aus.\\n\\nNeben der Plazenta wird HLA-G auch in zahlreichen anderen Geweben exprimiert und kann in Tumoren induziert oder hochreguliert werden. Da bei verschiedenen Tumoren die MHC-Klasse-I-Expression aufgrund von Mutationen im b2m-Gen gest\\xf6rt ist, wurden HLA-G1-Transfektanten in der b2m-negativen humanen Zellinie Daudi etabliert. Daudi HLA-G1-Transfektanten weisen gegen\\xfcber K-562 HLA-G1-Transfektanten eine reduzierte HLA-G-Proteinmenge auf. In Abwesenheit von b2m ist HLA-G1 au\\xdferdem nicht resistent gegen\\xfcber Endo H und kann auch nach Inkubation der Zellen bei niedrigen Temperaturen und Zugabe von b2m oder Ligand nicht auf der Zelloberfl\\xe4che nachgewiesen werden. Da von HLA-B27 bekannt war, da\\xdf b2m-freie Homodimere auf der Zelloberfl\\xe4che exprimiert werden k\\xf6nnen und eine Dimerisierung von HLA-G \\xfcber ungepaarte Cysteinreste m\\xf6glich ist, wurden die Daudi HLA-G1-Transfektanten auf Anwesenheit von HLA-G1-Dimeren untersucht. In Abwesenheit von b2m waren jedoch keine Dimere nachweisbar. Auch in funktionellen Experimenten mit LAK oder gd T-Zellen hatte die HLA-G-Expression in Daudi HLA?G1-Transfektanten keine Auswirkung auf die Zytotoxizit\\xe4t oder Proliferation der Effektorzellen. Die HLA-G1-Expression in b2m-negativen Tumoren tr\\xe4gt daher nicht zur Tumorprogression bei.\\n\\nEine Analyse der Unterschiede in der Expression und der Auswirkungen der HLA-G-Isoformen in verschiedenen Zellinien k\\xf6nnte Hinweise auf die Regulation und die Funktion der HLA-G-Expression liefern.'