Expression und Funktion des Apoptose-assoziierten Molekuls PHLDA1 im humanen Melanom
b'Das Melanom ist aufgrund seiner fr\\xfchzeitigen und h\\xe4ufigen Metastasierung sowie seiner\\nResistenz gegen\\xfcber Chemotherapeutika einer der b\\xf6sartigsten Tumoren des Menschen.\\nTrotz dieser gro\\xdfen medizinischen Bedeutung, ist \\xfcber die molekularen Mechanismen der\\nTumorigenese und Metastasierung bisher wenig bekannt. Deswegen ist die Identifizierung\\nund Charakterisierung von Genen, die in diesem Prozess eine Rolle spielen, von gr\\xf6\\xdfter\\nWichtigkeit.\\nPHLDA1 (pleckstrin homology-like domain family A member 1) wurde in unserem Labor\\nin einer mRNA differential display-Analyse auf der Suche nach Metastasierungs-\\nassoziierten Molek\\xfclen im Melanom isoliert. Es ist das humane Homolog zu dem murinen\\nTDAG51, das im Aktivierungs-induzierten Zelltod bei T-Zellen involviert ist. In der\\nvorliegenden Arbeit wurde PHLDA1 charakterisiert und seine Funktion im humanen\\nMelanom beschrieben.\\nEs wurden sechs monoklonale Antik\\xf6rper gegen PHLDA1 generiert, charakterisiert und\\ndie PHLDA1-Expression in der Westernblot-Analyse, in der Immunfluoreszenzf\\xe4rbung auf\\nlebenden Zellen, sowie immunhistochemisch auf Gewebegefrierschnitten untersucht.\\nDabei konnten folgende Resultate erzielt werden:\\nIn 11 untersuchten Zelllinien aus Melanommetastasen war die PHLDA1-Proteinmenge\\nsignifikant geringer (p < 0,0046) als in 17 Zelllinien aus Melanomprim\\xe4rtumoren. Die\\nverminderte Expression von PHLDA1 ist somit eine typische Eigenschaft von Zelllinien,\\ndie aus Melanommetastasen etabliert wurden.\\nIn normalem Haut- und Lymphknotengewebe war das PHLDA1-Protein nicht zu\\ndetektieren. Dagegen konnte in 55 untersuchten melanozyt\\xe4ren L\\xe4sionen eine PHLDA1-\\nspezifische F\\xe4rbung nachgewiesen werden. 80% der benignen N\\xe4vi, dagegen nur 41% der\\nPrim\\xe4rtumore und 22% der Metastasen zeigten eine starke und gleichm\\xe4\\xdfige PHLDA1-\\nExpression. Damit best\\xe4tigten die in vivo gemachten Untersuchungen die Resultate aus den\\nVersuchen mit den Zelllinien und zeigen, dass die PHLDA1-Expression w\\xe4hrend der\\nTumorprogression des humanen Melanoms vom Prim\\xe4rtumor bis hin zur Metastase\\nherunterreguliert wird.\\nMit den monoklonalen Anti-PHLDA1-Antik\\xf6rpern konnte PHLDA1 als zytoplasmatisches\\nProtein lokalisiert werden. Au\\xdferdem konnte gezeigt werden, dass der zweite\\nTranslationsstartpunkt des offenen Leserahmens von PHLDA1 verwendet wird. Zur Aufkl\\xe4rung der Funktion von PHLDA1, wurden jeweils vier stabile PHLDA1-\\nTransfektanten und zwei Neomycinvektor-Transfektanten in einer Melanomzelllinie und in\\neiner immortalisierten Epithelzelllinie generiert. Die Analyse der klonierten Transfektanten\\nergab ein langsameres Wachstum der PHLDA1-Transfektanten, eine reduzierte\\nKlonierungseffizienz sowie ein reduziertes Verm\\xf6gen Kolonien zu bilden. Au\\xdferdem\\nzeigten die PHLDA1-Transfektanten w\\xe4hrend des Wachstums eine st\\xe4rkere\\nKontaktinhibition.\\nDie konstitutive PHLDA1-Expression in den stabilen Transfektanten beeinflusste nicht den\\nZellzyklus. Dagegen konnte sowohl mit Hilfe der Annexin-V-Bindung sowie mit dem\\nTdT-abh\\xe4ngigen Einbau von FITC-markiertem dUTP (tunel-assay) gezeigt werden, dass\\ndie basale Apoptoserate in den PHDLA1-Transfektanten erh\\xf6ht war. Auch die Behandlung\\nmit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin erh\\xf6hte die Apoptoserate der PHLDA1-\\nTransfektanten signifikant gegen\\xfcber der Neomycinvektor-Transfektanten.\\nUm Aufschluss dar\\xfcber zu bekommen auf welchem molekularen Weg PHLDA1 die\\nApoptose beeinflusst, wurde nach zytoplasmatischen Interaktionspartnern von PHLDA1\\nim yeast two hybrid screen gesucht. Dabei konnten aus 5,6x106 gescreenten Hefeklonen\\neiner Gehirn-, einer Plazenta- und einer Hela-Genbank, zwei Gene isoliert werden, die in\\nHefe spezifisch mit PHLDA1 interagierten. Bei einem Gen handelte es sich um die p47-\\nUntereinheit des humanen Translationsinitiationsfaktor eIF3, bei dem anderen Gen um das\\nMRG-Gen (mammary-derived growth inhibitor-related gene). Translations-\\ninitiationsfaktoren werden mit der Blockade der Proteinbiosynthese w\\xe4hrend der Apoptose\\nin Verbindung gebracht und MRG ist als Gen identifiziert worden, dass eine\\nwachstumsreduzierende Wirkung auf Mammakarzinome aus\\xfcbt. Ob die beiden Proteine\\nauch die physiologischen Bindungspartner von PHLDA1 sind, ist noch nicht eindeutig\\ngekl\\xe4rt.\\nDas Expressionsmuster von PHLDA1, zusammen mit den funktionellen Ergebnissen, l\\xe4\\xdft\\nvermuten, dass die starke PHLDA1-Expression in den N\\xe4vi f\\xfcr deren gutartigen Charakter\\nmitverantwortlich ist. Im Melanom wird im Verlauf der Tumorprogression die PHLDA1-\\nExpression schrittweise reduziert und korreliert dann mit der zunehmenden Deregulation\\ndes Wachstums und der Ausbildung der Apoptoseresistenz. Die Assoziation zwischen der\\nPHLDA1-Expression und Apoptosesensitivit\\xe4t machen PHLDA1 zu einem interessanten\\nZielgen f\\xfcr die Entwicklung einer effizienteren Chemotherapie beim Melanom.'