Etablierung und Anwendung von Hochdurchsatz-Verfahren zur Identifizierung strahleninduzierbarer Gene in der Hefe
b'Die Microarray-Technik stellt eine sehr neue Technologie dar, die zwei wesentliche Vorteile\\ngegen\\xfcber herk\\xf6mmlichen Techniken besitzt. Zum einen ist durch Fluoreszenzmarkierung\\neine kompetitive Hybridisierung m\\xf6glich, so da\\xdf die behandelte Probe und die zugeh\\xf6rige\\nKontrolle in einem Experiment unter exakt gleichen Bedingungen untersucht werden k\\xf6nnen.\\nDer noch gr\\xf6\\xdfere Vorteil dieser Technik liegt in der M\\xf6glichkeit, die Expression mehrerer\\ntausend Gene gleichzeitig untersuchen zu k\\xf6nnen.\\nIn diesem Kapitel wurde der Einflu\\xdf verschiedener Strahlenarten (UV-C, \\u03b3-, Protonen- und\\nC6+-Ionen-Strahlung) auf die Expression von Hefegenen getestet. In einem ersten Schritt\\nwurden f\\xfcr die verschiedenen Noxen die \\xe4quitoxischen Dosen ermittelt, um die Strahlenarten\\nmiteinander vergleichen zu k\\xf6nnen. Als Kontrolle wurde zus\\xe4tzlich zu den verwendeten\\nStrahlenarten der Einflu\\xdf der alkylierenden Chemikalie MMS auf die Expression untersucht.\\nHierzu liegt bereits eine publizierte Arbeit vor (Jelinsky and Samson, 1999), mit der die hier\\nerzielten Ergebnisse verglichen werden konnten. F\\xfcnf der zehn am st\\xe4rksten induzierten Gene\\nwurden bereits von Jelinsky und Samson als stark induzierbar (Faktor >10) beschrieben. Die\\nDiskrepanz bei den f\\xfcnf restlichen Genen k\\xf6nnte trotz weitgehender Adaption des \\u201eJelinsky\\u201c-\\nProtokolls durch die Verwendung eines anderen Stammes oder durch die unterschiedliche\\nMicroarray Technik (hier cDNA-Arrays, bei Jelinsky und Samson Oligonukleotid-Arrays)\\nerkl\\xe4rbar sein. Eine Wiederholung der Hybridisierung ergab, da\\xdf die Expressionsunterschiede von den zehn am st\\xe4rksten induzierten Genen im ersten Experiment im\\nWiederholungsexperiment in neun F\\xe4llen best\\xe4tigt werden konnten. Interessanterweise lie\\xdfen\\nsich sieben dieser Gene in drei Gruppen einordnen, die r\\xe4umlich auf dem Chromosom direkt\\nbenachbart angeordnet sind und vermutlich koreguliert werden.\\nW\\xe4hrend bei MMS-behandelten Zellen die st\\xe4rksten Expressionsunterschiede beobachtet\\nwurden, zeigten s\\xe4mtliche verwendete ionisierende Strahlenarten einen geringen Effekt auf\\ndas Expressionsprofil. UV-Strahlung bewirkte ein intermedi\\xe4res Expressionsmuster bez\\xfcglich\\nder Transkriptmengen - es waren deutlich mehr Gene induziert bzw. reprimiert als bei den\\nionisierenden Strahlenarten, wohingegen im Vergleich zur MMS-Behandlung signifikant\\nweniger Expressionsver\\xe4nderungen festgestellt wurden. Die Analyse der Gene mit stark\\nver\\xe4nderten Transkriptmengen ergab, da\\xdf viele Gene, deren Induktion nach Bestrahlung\\nbereits fr\\xfcher publiziert worden ist, hier nicht als induzierbar gefunden wurden. Mehrere\\nFaktoren k\\xf6nnten daf\\xfcr verantwortlich sein: Niedrig exprimierte Gene (viele der DNAReparaturgene\\nsind niedrig exprimiert!) sind wie bei vielen anderen Methoden der\\nExpressionsmessung schwer detektierbar. Zudem k\\xf6nnen geringe Expressionsunterschiede\\n(kleiner Faktor zwei) bislang nicht festgestellt werden. Ferner konnten aufgrund des zeitlichen\\nRahmens meines Aufenthalts am NIEHS alle Hybridisierungen nur einmal (bei \\u03b3-Strahlung\\nzweimal) wiederholt werden, wodurch eine statistisch verl\\xe4\\xdfliche Aussage im Fall von\\ngeringen Expressionsunterschieden erschwert ist. Daher wurden in diesem Kapitel nur\\nExpressionsunterschiede von mindestens Faktor zwei ber\\xfccksichtigt.\\nTrotz dieser Schwierigkeiten gibt es einige Indizien, die f\\xfcr eine biologische Relevanz der\\ngezeigten Ergebnisse sprechen. So wurden in mehreren F\\xe4llen Genpaare (bzw. -gruppen)\\nidentifiziert, deren Transkriptmengen nach Bestrahlung \\xe4hnlich stark ver\\xe4ndert vorlagen und\\ndie bereits fr\\xfcher aufgrund funktioneller \\xc4hnlichkeiten in Genfamilien zusammengefasst\\nwurden (z.B. wurden f\\xfcnf ribosomale Gene mit mehr als dreifach erh\\xf6hter Transkriptmenge\\nnach UV-Bestrahlung gefunden).\\nAu\\xdferdem wurden die RNR-Gene bei allen getesteten Strahlenarten als stark induzierbar\\neingestuft, was aus fr\\xfcheren Expressionsmessungen bereits bekannt ist (Endo-Ichikawa, et al.,\\n1996; Huang and Elledge, 1997; Hurd and Roberts, 1989). Nach UV- und C6+-Ionen -\\nBestrahlung konnten zudem mit DUN1 und RAD53 zwei Gene als induzierbar eingestuft werden, die an der Signaltransduktion, die zur Induktion der RNR-Gene notwendig ist,\\nbeteiligt sind.\\nSchlie\\xdflich zeigte auch die stichprobenartige \\xdcberpr\\xfcfung der mit Microarrays erzielten\\nExpressionsdaten durch Northern-Hybridisierungen eine gute \\xdcbereinstimmung. So konnten\\ndie in den drei untersuchten Genen (EGT2, HSP30 und YPR015C) gefundenen\\nTranskriptionsver\\xe4nderungen nach Bestrahlung bzw. Behandlung mit MMS verifiziert\\nwerden.\\nNeben den Genen mit bekannter Funktion in der DNA-Schadensprozessierung wurden einige\\nGene identifiziert, die bislang nicht in Verbindung mit DNA-Sch\\xe4digung gebracht worden\\nsind. So zeigte sich nach Behandlung mit allen untersuchten Strahlenarten (auch MMS) eine\\ndeutliche Verringerung der Transkriptmenge des EGT2-Gens, f\\xfcr das eine Rolle in der\\nZellzykluskontrolle gezeigt wurde (Kovacech, et al., 1996). Eine erh\\xf6hte Transkriptmenge\\nwurde f\\xfcr den Leserahmen YLL030C nach UV-,C6+- und \\u03b3-Bestrahlung gefunden. Bei\\ns\\xe4mtlichen verwendeten Strahlenarten wurde eine ebenfalls deutlich erh\\xf6hte Transkriptmenge\\nf\\xfcr den Leserahmen YPR015C gezeigt, der aufgrund von Sequenzhomologien als m\\xf6glicher\\nTranskriptionsfaktor diskutiert wird (Bohm, et al., 1997).\\nInwieweit Gene, die lediglich bei einer Bestrahlungsart induziert bzw. reprimiert vorlagen,\\ntats\\xe4chlich strahlenspezifisch reguliert sind, mu\\xdf erst durch weitergehende Analysen gekl\\xe4rt\\nwerden.'