Die auergewohnliche Diversitat der der Proteolipide in Archaea: Multimere und monomere Rotoren mit sechs bis dreizehn Ionenbindestellen in A1AO-ATPasen
b'Zusammenfassung\\n\\n1. Das f\\xfcr das Proteolipid aus Methanocaldococcus jannaschii kodierende Gen atpK wurde in E. coli DH5alpha und in dem Minizell-Produzenten E. coli DK6 exprimiert. Das Genprodukt wurde durch radioaktive Markierung nachgewiesen.\\n\\n2. Aus den Membranen der thermophilen, hydrogenotrophen methanogenen Archaea M. jannaschii, Methanothermobacter thermautotrophicus, Methanothermobacter marburgensis sowie aus den Membranen des mesophilen, methylotrophen methanogenen Arch\\xe4ons Methanosarcina mazei G\\xf61 wurden mit Chloroform/Methanol die Proteolipide der A1AO-ATPasen und die MtrD-Untereinheiten der Methyltetrahydromethanopterin:CoenzymM-methyl-transferase extrahiert. Die einzelnen Peptide wurden mittels N-terminaler Sequenzierung identifiziert.\\n\\n3. Durch MALDI-TOF-Analyse wurde die molekulare Masse des maturen Proteolipids aus M. jannaschii zu 21316 Da und 21183 Da (Methionin-freie Form) bestimmt. Zusammen mit der Gensequenz konnte daraus gefolgert werden, da\\xdf es sich um eine triplizierte Form des bakteriellen 8-kDa Proteolipids handelt, also 3 Haarnadel-Dom\\xe4nen ausweist. Die ionentranslozierenden Carboxylate sind nur in Haarnadel 2 und 3 konserviert. Bei einer angenommenen Anzahl von 24 Helices im c-Oligomer bedeutet das, da\\xdf ein Ionen/ATP-Verh\\xe4ltnis von 2,7 f\\xfcr die Synthese von ATP ausreichen w\\xfcrde.\\n\\n4. Die Proteolipide aus M. thermautotrophicus und M. marburgensis besitzen duplizierte Proteolipide. Die aktiven Carboxylat-Reste sind im Gegensatz zu den bisher bekannten duplizierten Proteolipiden der V1VO-ATPasen in beiden Haarnadeln konserviert.\\n\\n5. Die arch\\xe4ellen A1AO-ATPasen-Operone der Pyrococcen enthalten ebenfalls Gene, die f\\xfcr duplizierte Proteolipide kodieren. Allerdings sind die f\\xfcr die Ionentranslokation essentiellen Carboxylat-Reste wie in den Proteolipiden der V-Typ-ATPasen nur in der zweiten Haarnadel vorhanden. Die Abtrennung der A1AO- und V1VO-ATPasen mu\\xdf daher vor der Entwicklung der Eukaryonten erfolgt sein.\\n\\n6. Sequenzanalysen haben gezeigt, da\\xdf das Proteolipid-Gen aus Methanopyrus kandleri dreizehnmal so gro\\xdf wie das aus Bakterien ist. Es kodiert f\\xfcr ein Protein mit 13 Haarnadel-Dom\\xe4nen. Die Ionenbindstelle ist in jeder Haarnadel konserviert. \\n\\n7. Alle heute bekannten Formen der Proteolipide der V- und F-ATPasen waren schon in den Archaea enthalten. Die Vielfalt an Proteolipid-Gr\\xf6\\xdfen und -Formen der arch\\xe4ellen ATPasen l\\xe4\\xdft vermuten, da\\xdf sie ein Reservoir an M\\xf6glichkeiten darstellen, aus denen die V1VO- und F1FO-ATPasen gespeist wurden. \\n\\n8. Durch Sequenzvergleich mit den Na+-translozierenden Proteolipiden der bakteriellen F1FO-ATPasen wurde auch in den Proteolipiden der A1AO-ATPasen ein Na+-Bindemotiv identifiziert. Es lautet: P/S/T-XXX-Q/E (Motiv I in Helix eins), ET/S (Motiv II in Helix zwei). \\n\\n9. Aus Membranen von Sulfolobus acidocaldarius und M. jannaschii wurden durch Chloroform/Methanol Lipide extrahiert, anschlie\\xdfend wurde aus diesen Lipiden Liposomen hergestellt, in die die A1AO-ATPase aus M. jannaschii rekonstituiert wurde. Die Synthese von ATP konnte jedoch nicht nachgewiesen werden.\\n\\n10. Die ATPase-Gene ahaE, ahaC, ahaF, ahaA, ahaB, ahaD und ahaG wurden in den Fusionsvektor pMal kloniert und in Escherichia coli exprimiert. Die Fusionsproteine wurden aus dem Zellextrakt isoliert und zur Immunisierung von Kanninchen eingesetzt. Die erhaltenen Antiseren gegen die ATPase-Untereinheiten AhaA, AhaB, AhaC und AhaE waren spezifisch und wurden f\\xfcr die Analysen dieser Arbeit eingesetzt.\\n\\n11. Das f\\xfcr die gesamte A1AO-ATPase kodierende Operon ahaHIKECFABDG des methanogenen Arch\\xe4ons Methanosarcina mazei G\\xf61 wurde in den Expressionsvektor pVSBAD2 hinter den ara-Promotor kloniert. Das Konstrukt wurde pRT1 genannt. \\n\\n12. Die auf pRT1 lokalisierten Gene wurden heterolog in E. coli DK8 exprimiert. Die A1AO-ATPase war in E. coli membran-assoziiert und funktionell. Die spezifische ATPase-Aktivit\\xe4t an Membranen von E. coli DK8 betrug 150 mU/mg Protein.\\n \\n13. DCCD und der f\\xfcr arch\\xe4elle ATPasen spezifische Inhibitor DES hemmten das Enzym. Die I50-Wert betrugen 0,5 mM/mg Protein, beziehungsweise 200 nmol/mg Protein.\\n\\n14. Die Synthese von AhaA, AhaB, AhaC, AhaE, AhaH, AhaK, und zum ersten Mal auch des gesamten AhaI, konnten nachgewiesen werden. Gegen AhaF, AhaD und AhaG lagen keine funktionellen Antik\\xf6rper vor.'