Charakterisierung von Domanen des schnellen konventionellen Kinesins aus Neurospora crassa mit Hilfe C-terminal verkurzter und chimarer Mutanten

Published: Nov. 29, 2002, 11 a.m.

b'Konventionelle Kinesine sind Mikrotubuli assoziierte Motorproteine. Sie benutzen die Energie der ATP-Hydrolyse, um gerichtete Bewegungen entlang des Zytoskeletts zu erm\\xf6glichen. Tierische konventionelle Kinesine sind aus zwei schweren Ketten und zwei leichte Ketten aufgebaut. Die niederen Organismen, wie Pilze, besitzen dagegen nur die zwei schweren Ketten. Das konventionelle Kinesin des roten Brotschimmels Neurospora crassa (NcKin) bewegt sich wie auch andere Pilzkinesine in vitro im mikroskopischen Gleittest mit Geschwindigkeiten, die etwa drei- bis f\\xfcnffach h\\xf6her sind (zwischen 2,0 und 2,6 \\xb5m/s), als die der tierischen Kinesine (zwischen 0,2 und 0,8 \\xb5m/s).\\nTrotz der hohen Sequenz\\xe4hnlichkeit von Tier- und Pilzkinesinen, sind spezifische Unterschiede festgestellt worden, vor allem im Halsbereich. Weil es bisher keine zufrieden stellende Erkl\\xe4rung der schnellen Gleitgeschwindigkeit von NcKin gibt, liegt es nahe, in diesen pilzspezifischen Sequenzbereichen die Grundlage hierf\\xfcr zu vermuten.\\nIn dieser Dissertation wurde daher untersucht, welchen Einfluss die einzelnen Kinesin-Dom\\xe4nen auf die Motilit\\xe4t und den ATP-Umsatz haben. Zu diesem Zweck wurden (i) bakterielle Expressionsvektoren hergestellt, die f\\xfcr C-terminal verk\\xfcrzte Kinesinkonstrukte kodieren. Hierbei wurden zun\\xe4chst rekombinante Motoren hergestellt, die an den Dom\\xe4nengrenzen endeten, wie sie durch kristallografische Modelle und Sekund\\xe4rstrukturvorhersagen abgeleitet worden waren. Aufgrund der Ergebnisse an diesen Proteinen wurden weitere C-terminal verk\\xfcrzte Kinesine konstruiert, die eine genauere funktionelle Kartierung der Scharnierdom\\xe4ne zum Ziel hatten. Mit diesen Konstrukten wurden kinetische Studien durchgef\\xfchrt, um ein Gesamtbild von deren ATPase-Aktivit\\xe4t und Prozessivit\\xe4t zu bekommen. Da \\xe4hnliche Studien an dem homologen Drosophila Kinesin durchgef\\xfchrt worden waren, war ein direkter Vergleich zu diesen Vertretern der Tierkinesine m\\xf6glich. (ii) Um den Beitrag der einzelnen Dom\\xe4nen zur hohen Geschwindigkeit von NcKin zu ermitteln, wurden in einem zweiten Teil der vorliegenden Arbeit gezielt NcKin Dom\\xe4nen in die entsprechenden Bereiche des humanen Kinesins eingef\\xfchrt, und die entstandenen Chim\\xe4ren auf einen Geschwindigkeitszuwachs getestet.'