Analyse der Zellsortierung und Zellbewegung von Dictyostelium discoideum mittels konfokaler 4DMikroskopie
b'Methoden der multidimensionalen konfokalen Mikroskopie wurden f\\xfcr die in vivo\\nBeobachtung dynamischer Prozesse in der Am\\xf6be Dictyostelium discoideum verwendet. Um\\ndiese Vorg\\xe4nge sichtbar zu machen, wurde Gr\\xfcn Fluoreszierendes Protein (GFP) als Reporter\\nvon Genexpression und als Fusionsprotein eingesetzt. Mit Hilfe von 4D-Mikroskopie und\\nMehrkanal-Detektion konnten dabei in vivo die Zellsortierung in vielzelligen Aggregaten und\\ndie intrazellul\\xe4re Lokalisierung des Zytoskelett-Proteins Severin visualisiert und analysiert\\nwerden.\\nEs wurde eine Methode entwickelt, spektral unterschiedliche GFP-Varianten im\\nKonfokalmikroskop simultan zu detektieren und verl\\xe4\\xdflich zu trennen. Aufgrund der\\nAnregungswellenl\\xe4nge und der Verwendung nur eines Aufnahmevorgangs zur Erfassung\\nbeider GFP-Varianten eignet sich dieser Ansatz zur schonenden Beobachtung lebender Zellen\\nauch \\xfcber l\\xe4ngere Zeitr\\xe4ume. Diese Eigenschaften erm\\xf6glichen dar\\xfcber hinaus die\\nVerwendung dieser Konfiguration bei den wiederholten Aufnahmen einer 4D-Messung.\\nIn D. discoideum-Slugs wurde die Lokalisierung von Prestalk-Zellen (pstA- und pst0-Zellen)\\nw\\xe4hrend der Migration und der Spitzenneubildung mit GFP als Reporter f\\xfcr spezifische\\nGenexpression untersucht. In migrierenden Slugs fallen Prestalk-Zellen aus dem pstA-Bereich\\nder Spitze in den Prespore-Bereich zur\\xfcck. Dieses Zur\\xfcckfallen in der zentralen L\\xe4ngsachse\\nl\\xe4\\xdft sich durch die Organisation der Spitzenregion durch cAMP-Spiralwellen mit einem\\nZentrum in der L\\xe4ngsachse erkl\\xe4ren. Prestalk-Zellen gelangen \\xfcber diesen Weg aus der Spitze\\nin den Prespore-Bereich. An der Neubildung von Spitzen im Prespore-Bereich sind ehemalige\\nPrestalk-Zellen gemeinsam mit den Anterior-like-Zellen des Prespore-Bereichs ma\\xdfgeblich\\nbeteiligt. Diese Zelltypen bewegen sich an die Slugoberseite und bilden dort rotierende\\nZentren, aus denen sich neue Spitzen bilden. Das Verhalten dieser Zellgruppen und die 4DTrajektorien\\neinzelner Zellen deuten auf eine Organisation dieser Zentren durch cAMPSignale.\\nDar\\xfcber hinaus konnte gezeigt werden, da\\xdf es innerhalb dieser Zellen Gruppen gibt,\\ndie zu unterschiedlichen Zeiten in neue Spitzen rekrutiert werden. PstA-Zellen sind in neuen\\nSpitzen wieder im vordersten Bereich lokalisiert, obwohl sie aus dem Prespore-Bereich\\nkommen, w\\xe4hrend pst0-Zellen im gesamten Prestalk-Bereich zu finden sind.\\nArtspezifische Zellsortierungsprozesse gemeinsam vorkommender Dictyostelium-Arten\\nwurden mittels der Markierung von Zellen der beteiligten Arten untersucht. Es konnte gezeigt\\nwerden, da\\xdf die Sortierung von D. discoideum/D. mucoroides-Mischungen schon in den Aggregationsstr\\xf6men anf\\xe4ngt und im Mound abgeschlossen wird. Die Trennung erfolgt \\xfcber\\nUnterschiede in der Zelladh\\xe4sion. Erheblich beschleunigt wird dieser Sortierungsvorgang\\ndurch die gerichtete chemotaktische Bewegung beider Arten auf dieselben Signale, die bei\\nden sich in den Zellstr\\xf6men schneller bewegenden D. mucoroides-Zellen zu einer\\nAnreicherung im Moundzentrum f\\xfchrt. Somit sind in vivo zwei Faktoren gemeinsam f\\xfcr die\\nartspezifische Sortierung von D. discoideum und D. mucoroides verantwortlich. In\\nMischungen von D. discoideum und Polysphondylium spec. geschieht die Aussortierung \\xfcber\\ndie Nutzung unterschiedlicher Botenstoffe f\\xfcr die Chemotaxis, so da\\xdf die Arten getrennt\\naggregieren. Es konnte gezeigt werden, da\\xdf diese getrennte Aggregation sehr spezifisch ist\\nund es dennoch zu einer Interaktion zwischen D. discoideum und fortgeschrittenen\\nPolysphondylium-Aggregaten kommt, da in Polysphondylium in sp\\xe4ten Aggregationsphasen\\ncAMP f\\xfcr die interzellul\\xe4re Kommunikation verwendet wird. In dieser Phase wird von\\nPolysphondylium sowohl cAMP als auch Glorin sekretiert.\\nSeverin ist ein mit Gelsolin verwandtes 40 kDa Protein, das F-Aktin-Filamente fragmentiert\\nund an das (+)-Ende des entstehenden Fragments bindet. Mit Hilfe eines GFP-Fusionsproteins\\nwurde die intrazellul\\xe4re Lokalisierung dieses Proteins in vivo w\\xe4hrend einer Vielzahl\\nzellul\\xe4rer Aktivit\\xe4ten untersucht. Severin ist in den aktiven Bereichen des F-Aktin Zellkortex\\nangereichert. Obwohl die Morphologie von D. discoideum-Zellen in den verschiedenen\\nPhasen der Entwicklung sehr unterschiedlich ist, ist die Lokalisierung von Severin in allen\\nStadien prim\\xe4r von der Bildung neuer Zellforts\\xe4tze trennbar. Die Anreicherung von Severin\\nist hingegen mit der Bewegung der Zelle in diese neu gebildeten Forts\\xe4tze assoziiert. Erstmals\\nwurde im Rahmen dieser Arbeit der Effekt von cAMP-Signalen auf das Zytoskelett einzelner\\nZellen in Aggregationsstr\\xf6men ausf\\xfchrlich dargestellt.'