Modulation der DNA-Mechanik durch Methylierung und Transkriptionsfaktoren
Genregulation gibt der Zelle die Kontrolle \xfcber Struktur und Funktion, und ist die Basis f\xfcr zellul\xe4re Differenzierung, Morphogenese und die Vielseitigkeit und Anpassungsf\xe4higkeit von jedem Organismus. Um zu begreifen, wie eine Zelle ihre Funktion organisiert und wie sich ganz individuelle Organismen ausbilden, obwohl die gleichen genetischen Informationen vorhanden sind, muss man die Regulation der Genexpression im Detail verstehen. Diese Regulation wirkt an verschiedenen Stellen der Genexpression und besteht aus einer Vielzahl von komplexen Prozessen, die untereinander verbunden sind. Somit ist das Verst\xe4ndnis der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen und ihres Zusammenspiels f\xfcr Biologie und Biophysik von gro\xdfer Bedeutung.\nZiel dieser Arbeit ist die Untersuchung von Wechselwirkungen und Wechselwirkungskr\xe4ften zwischen Biomolek\xfclen, die an der Genregulation und der Epigenetik, auf der Ebene der Transkription beteiligt sind. Insbesondere konnten Protein-DNA-Wechselwirkungen und der Einfluss epigenetischer DNA-Modifikationen quantifiziert werden. F\xfcr die Messungen wurde ein molekularer Kraftsensor und als dessen Erweiterung ein molekularer Analog-Digital-Wandler entwickelt. Diese molekularen Sensoren erm\xf6glichen die direkte Messung der Wechsel- wirkungskr\xe4fte zwischen DNA und Liganden. Mit dem molekularen Kraftsensor k\xf6nnen au\xdferdem hochparallel Messungen durchgef\xfchrt werden, wobei durch den symmetrischen, molekularen Aufbau zudem eine sehr hohe Sensitivit\xe4t erreicht wird. Die Verwendung dieser Methode erm\xf6glichte es, den Einfluss der epigenetisch modifizierten Basen Methylcytosin und Hydroxymethylcytosin (\u201e5. und 6. Base der DNA\u201c) auf die mechanische Stabilit\xe4t der DNA- Doppelhelix zu untersuchen.\nEs wird gezeigt, dass mit dem aus DNA-Oligomeren aufgebauten molekularen Kraftsensor Protein-DNA-Wechselwirkungen detektiert und deren Dissoziationskonstanten bestimmt werden k\xf6nnen. Unter anderem wird die Wechselwirkung der Endonuklease EcoRI mit ihrer DNA- Erkennungssequenz quantifiziert. Hierf\xfcr wurden molekulare Kraftsensoren in Zipper- und Scher-Geometrie entworfen. Bei dem neu entwickelten Aufbau des Kraftsensors mit integriertem F\xf6rster-Resonanzenergietransfer-Farbstoffpaar gen\xfcgt schon eine Fl\xe4che von 25 !m2, um die St\xe4rke von Ligand-DNA-Wechselwirkungen bestimmen zu k\xf6nnen. Diese Fl\xe4che liegt deutlich unterhalb der Messfleckgr\xf6\xdfe aktueller DNA-Mikroarrays. Damit erf\xfcllt der molekulare Kraftsensor bez\xfcglich der Messfleckdichte die Voraussetzung f\xfcr moderne Hochdurchsatz- Methoden.\nIn einem zweiten Schritt wird der molekulare Kraftsensor zu einem \u201emolekularen Analog- Digital-Wandler\u201c erweitert. In Analogie zum elektronischen Flash-Analog-Digital-Wandler, bei dem mehrere Komparatoren mit unterschiedlichen Referenzschaltungen parallel geschaltet sind, werden beim molekularen Analog-Digital-Wandler parallel r\xe4umlich getrennte, molekulare Kraftsensoren mit unterschiedlich stabilen Referenz-Wechselwirkungen zur Bestimmung einer unbekannten molekularen Wechselwirkung verwendet. Durch eine Kompensationsmessung wird dann die Kraft von Ligand-DNA-Wechselwirkungen bestimmt. Es werden die Wechsel- wirkungen eines Pyrrol-Imidazol Hairpin-Polyamides, der Endonuklease EcoRI und des Transkriptionsfaktors p53 zur jeweiligen DNA-Erkennungssequenz vermessen. Eine hoch- parallele Version mit Messfleckgr\xf6\xdfen mit einem Durchmesser von minimal 15 !m konnte realisiert werden. Abgeleitet vom Bell-Evans-Modell wurde ein analytisches Modell zur Beschreibung des molekularen Analog-Digital-Wandlers entwickelt.\nNeben den Protein-DNA-Wechselwirkungen werden die epigenetisch modifizierten DNA- Basen Methylcytosin (mC) und Hydroxymethylcytosin (hmC) untersucht. Es wird der Nachweis erbracht, dass sich die mechanische Stabilit\xe4t der DNA-Doppelhelix bei Separation in zwei Einzelstr\xe4nge in beiden F\xe4llen signifikant um mehrere Pikonewton \xe4ndert. Die St\xe4rke des Effekts ist abh\xe4ngig von der DNA-Sequenz und der Richtung der angelegten Kraft. Durch Einzelmolek\xfcl-Kraftspektroskopie wird eine Reduzierung der Potentialweite durch mC aufgezeigt. Au\xdferdem konnte mit Hilfe von Molekulardynamik-Simulationen der Effekt f\xfcr mC und teilweise auch f\xfcr hmC auf molekularer Ebene aufgekl\xe4rt werden. Es wird ein Modell entwickelt, das erkl\xe4rt, wie dieser Effekt einen Einfluss auf die Genregulation aus\xfcben kann.