BROADCASTS.com

In den zellul\xe4ren Stoffwechsel- und Signalnetzwerken existiert eine Vielzahl von logischen Abh\xe4ngigkeiten, die auf Prozesse auf molekularer Ebene zuru\u0308ckzufu\u0308hren sind. So l\xe4sst sich beispielsweise die Effizienz einer biochemischen Reaktion u\u0308ber Enzyme regulieren, deren Aktivit\xe4tsgrad von \xe4u\xdferen Parametern abh\xe4ngt. Kraft stellt eine dieser Einflussgr\xf6\xdfen dar.\n\nDiese Arbeit befasst sich damit, das Verhalten mehrerer, logisch verknu\u0308pfter, molekularer Dom\xe4nen unter Krafteinwirkung zu studieren und sich deren Eigenschaften fu\u0308r nanotechnologische Verfahren zu Nutze zu machen.\n\nNeben der Untersuchung von in der Natur vorkommenden Proteinen mit multiplen Dom\xe4nen wurden artifizielle DNA- und proteinbasierte Systeme mit verschiedener Bindungsst\xe4rke konstruiert. Dies erm\xf6glicht den gerichteten Transport einzelner, molekularer Bausteine mit der Pr\xe4zision eines Rasterkraftmikroskopes im Nanometer-Bereich. Mithilfe dieser Single-Molecule Cut-and-Paste (SMCP) Technik k\xf6nnen auf der Basis gerichteter, molekularer\nErkennung r\xe4umliche Arrangements funktioneller Bausteine geschaffen werden. Diese lassen sich mittels Fluoreszenzmikroskopie als isoliertes System betrachten.\n\nDie Zielsetzung bei der Untersuchung der natu\u0308rlichen Systeme war es, deren Abh\xe4ngigkeiten zu verstehen und herauszufinden, wie sich diese mit ihrer Funktion und den an das Protein gestellten Umgebungsbedingungen in Einklang bringen lassen. Die dabei gewonnene Erkenntnis liefert nicht nur wichtige Beitr\xe4ge zur biologischen und medizinischen Grundlagenforschung, sondern kann, wie am Beispiel der SMCP-Technik ersichtlich, auch hilfreich bei der Entwicklung neuartiger Messmethoden der molekularen Bio- und Nanotechnologie sein.\n\nMittels Einzelmolek\xfclkraftspektroskopie im \u201eKonstante-Kraft\u201c (engl. Force-Clamp) Modus wurde die Kooperativit\xe4t der f\xfcnf Proteindom\xe4nen des Enzyms Titinkinase untersucht. Dieses Muskelprotein wandelt in der Skelett- und Herzmuskulatur mechanische in biochemische Signale um und regelt dadurch den Umsatz weiterer Proteine und die Expression von Genen. Es wird gezeigt, dass sich die einzelnen mechanisch induzierten Entfaltungsschritte gegenseitig bedingen und dass dies inh\xe4rent durch die molekulare Faltung des Proteins vorgegeben wird. Da Kraft zum nat\xfcrlichen Parameterraum dieses Molek\xfcls geh\xf6rt, muss seine Struktur an kraftinduzierte konformationelle \xc4nderungen angepasst sein. Durch die Abh\xe4ngigkeit der Energiebarrieren w\xe4hrend der Entfaltung wird gew\xe4hrleistet, dass stabilisierende und enzymatisch wirksame Dom\xe4nen nicht vor regulatorischen Dom\xe4nen entfalten. \n\nMyosin-Light-Chain Kinase (MLCK) ist ein weiteres Muskelenzym, bei dem es Hinweise auf eine mechanische Aktivierbarkeit gibt. Einzelmolek\xfclexperimente dieser Dissertation zeigen, dass die Entfaltung der Kinase ebenfalls in mehreren Schritten vonstatten geht und dass einer der Zwischenzust\xe4nde durch ATP-Bindung stabilisiert wird. Die absoluten Entfaltungskr\xe4fte liegen dabei unter denen der Titinkinase, was der Hypothese der mechanischen Aktivierbarkeit entgegenkommt.\n\nAls weiteres System wurde das Cellulosom des thermophilen Bakteriums Clostridium Thermocellum auf seine mechanische Stabilit\xe4t \xfcberpr\xfcft. Cellulosome sind an der Au\xdfenseite von Bakterien und Pilzen verankerte Proteinkomplexe, die in der Lage sind Lignozellulose zu zersetzen. Bei der Prozessierung der Cellulose k\xf6nnen im Cellulosom hohe Scherkr\xe4fte auftreten, da dieses das gesamte Bakterium mit dem makromolekularen Substrat verkn\xfcpft. Mittels AFM-basierter Kraftspektroskopie wurde die Wirkung von Kraft auf einen Verbund verschiedener Konstituenten eines Cellulosoms untersucht. Es wird gezeigt, dass sich der Komplex im Vergleich zu anderen Biomolek\xfclen durch eine extrem hohe mechanische Stabilit\xe4t auszeichnet. Innerhalb der hohen Entfaltungskr\xe4fte besteht eine Hierarchie f\xfcr die verschiedenen Komponenten. Bei vergleichsweise niedrigen Kr\xe4ften entfalten die enzymatischen Dom\xe4nen gefolgt von mittleren Kr\xe4ften f\xfcr das Entkoppeln der Enzyme mit dem Bindungspartner Cohesin. Sehr hohen Kr\xe4ften halten die intramolekularen Wechselwirkungen der Cohesine und der Cellulose bindenden Dom\xe4nen stand. Die Abstufung hoher Stabilit\xe4ten stellt eine sehr gute Anpassung an die nat\xfcrlichen Anforderungen des Proteinkomplexes dar.\n\nF\xfcr die durchgef\xfchrten Messungen wurde ein modulares Kraftmikroskop (AFM) entwickelt, das sich mit einem einzelmolek\xfclsensitiven Fluoreszenzmikroskop kombinieren l\xe4sst. Die spezielle Konstruktion weist eine extrem hohe mechanische Stabilit\xe4t auf. Mittels einer photothermischen Regelung kann das AFM dar\xfcber hinaus f\xfcr sensitive Bildgebung weicher molekularer Oberfl\xe4chen oder in einen extrem schnellen kraftspektroskopischen Messmodus mit konstanter Zugkraft verwendet werden. Die akkurate Arbeitsweise des Systems wurde in einem internationalen Vergleichsversuch best\xe4tigt.