Kraftspektroskopische Untersuchung einzelner Zytoskelett-Proteine
Die Kraftspektroskopie hat sich als eine moderne Methode zur Untersuchung der Elastizit\xe4t und Entfaltung einzelner Proteine etabliert. Kraftspektroskopische Experimente zeichnen sich unter anderem dadurch aus, dass die Entfaltungskinetik einzelner Proteine bestimmt werden kann. In dieser Arbeit wurde die Kraftspektroskopie zur Analyse der Elastizit\xe4t und der Entfaltungskinetik einzelner Zytoskelett-Proteine verwendet. Die untersuchten Molek\xfcle, die Superhelix-Struktur des Myosin Schwanzes und das Aktin-bindende Protein Filamin (ddFLN) repr\xe4sentieren dabei zwei wichtige Strukturmotive der Proteinfaltung. Die Messungen wurden mit dem Ziel durchgef\xfchrt, ein detailliertes Verst\xe4ndnis hinsichtlich des Zusammenhangs zwischen der Struktur der Proteine und deren mechanischen Eigenschaften zu gewinnen. Der Anwendungsbereich der Methode konnte mit Hilfe eines neu entwickelten Messprotokolls erweitert werden. So wurde in R\xfcckfaltungsexperimenten neben der Entfaltungskinetik auch die R\xfcckfaltungskinetik einzelner Proteine bestimmt.\n\nDie kraftspektroskopische Untersuchung des Schwanzes des Muskelmotor-Proteins Myosin II zeigte, dass das Molek\xfcl \xfcber elastische Dehnungseigenschaften verf\xfcgt. Die Superhelix-Struktur des Schwanzes weist ein charakteristisches Kraftdehnungsverhalten auf, das bei Dehnung und Entspannung des Molek\xfcls reversibel ist. Das Kraftdehnungsverhalten der Superhelix konnte erfolgreich durch ein Zwei-Zustands-Modell analytisch beschrieben werden. Das Modell beruht auf der Annahme, dass einzelne Segmente der Helix entweder einen gefalteten oder entfalteten Zustand einnehmen. Ferner liegt dem Modell zugrunde, dass ein thermodynamisches Gleichgewicht beim \xdcbergang zwischen den Zust\xe4nden besteht.\n\nIn den Experimenten mit dem Aktin-bindenden Protein ddFLN wurden die Entfaltungskr\xe4fte der Immunoglobulindom\xe4nen sowie die mechanische Stabilit\xe4t der Dimerbindung des inelastischen Molek\xfcls bestimmt. Es zeigte sich, dass die Dimerbindung im Vergleich zu den benachbarten Dom\xe4nen von ddFLN \xfcber eine gr\xf6\xdfere mechanische Stabilit\xe4t verf\xfcgt. Experimente mit verschiedenen Konstrukten des Molek\xfcls zeigten au\xdferdem, dass die Entfaltung einer der ddFLN-Dom\xe4nen, n\xe4mlich Dom\xe4ne 4 (ddFLN4), \xfcber einen stabilen Zwischenzustand erfolgt. Auf Basis der NMR-Struktur und der kraftspektroskopischen Daten verschiedener Mutationen von ddFLN4 wurde eine Analyse der Prim\xe4rstruktur dieses Zwischenzustandes vorgenommen. Demnach entfalten im ersten Entfaltungsschritt 50 Aminos\xe4uren, w\xe4hrenddessen die restlichen 50 Aminos\xe4uren von ddFLN4 den stabilen Zwischenzustand bilden.\n\nWiederholtes Dehnen und Entspannen von ddFLN ergab, dass es sich bei dem Entfaltungszwischenzustand von ddFLN4 ebenfalls um einen Faltungszwischenzustand handelt. Die Analyse der R\xfcckfaltungsereignisse f\xfchrte zu dem Ergebnis, dass die R\xfcckfaltung von ddFLN4 nur durch ein kinetisches Drei-Zustands-Modell mit einem obligaten Zwischenzustand beschrieben werden kann. Der Zwischenzustand stellt also einen \u201eon-pathway\u201c Zwischenzustand dar, der von ddFLN4 zuerst eingenommen wird, bevor die Dom\xe4ne in ihre native Struktur \xfcbergeht. Die quantitative Bestimmung der Faltungskinetik von ddFLN4 erfolgte durch Anpassung des Modells an die Daten. Der Vergleich der Faltungskinetik von ddFLN4 und allen anderen Dom\xe4nen von ddFLN f\xfchrte zu dem Ergebnis, dass ddFLN4 mit Zwischenzustand eine ca. 10fach schnellere Faltung aufweist, obwohl alle Dom\xe4nen eine homologe Struktur besitzen. Dom\xe4ne ddFLN4 stellt demnach ein Beispiel dar, inwiefern ein Faltungszwischenzustand zu einer substantiellen Beschleunigung der Faltung f\xfchren kann.