Bindung von MARCKS an anionische Phospholipidvesikel, Aggregations- und Transportverhalten von synthetischen Gentransfer-Komplexen

Published: Dec. 22, 2004, 11 a.m.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) zum ersten Mal systematisch die Bindung von fluoreszenzmarkierten Peptiden an anionischen Lipidmembranen untersucht. Mit dieser Methode konnten Einzelmolek\xfcl-Messungen zur Bindung von myristoyliertem Alanin-reichen C Kinase Substrat, MARCKS (151-175), an unilamellare Vesikel mit einem Durchmesser von 100 nm durchgef\xfchrt werden. Die Vesikel bestanden aus dem neutralen Lipid Phosphatidylcholine (PC) und den negativ geladenen Lipiden Phosphatidylserine (PS) oder Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2). Eine Signal/Rausch-Analyse erm\xf6glichte die Bestimmung der Sensitivit\xe4t und des linearen Messbereichs der Methode. Auf Grund der unterschiedlichen Korrelationszeiten der freien und gebundenen Peptide folgte aus den gemessenen Autokorrelationskurven der prozentuale Anteil des gebundenen Pepids. Die Bindung von MARCKS(151-175) an die anionischen Vesikel wurde f\xfcr verschiedene prozentuale Anteile von PS und PIP2 gemessen. Sie war umso st\xe4rker, je h\xf6her der Anteil anionischer Lipide in der Membran und damit die attraktive elekrostatische Wechselwirkung war. Die ermittelten Bindungskonstanten stimmten gut mit den Resultaten \xfcberein, die mit etablierten konventionellen Techniken wie NMR, ITC oder Spinmarkierung gewonnen wurden. Die Experimente konnten zeigen, dass mit FCS direkte Messungen von nanomolaren Peptidkonzentrationen m\xf6glich sind. FCS stellt eine pr\xe4zise Methode zur Untersuchung der Wechselwirkung von Peptiden und Proteinen mit Lipidmembranen dar. \n\nIm zweiten Teil der Arbeit wurde die Selbstorganisation und das Aggregationsverhalten von verschiedenen synthetischen Gentransfer-Komplexen studiert. Mit der Methode der quantitativen Fluoreszenzmikroskopie wurde die Gr\xf6\xdfenverteilung bestimmt und die Zahl der Plasmide pro Gentransfer-Komplex berechnet. Die Polyplexe stellen im Unterschied zu den Lipoplexen unter den experimentellen Bedingungen ein polydisperses kolloidales System dar. Unter dem Einfluss eines nat\xfcrlichen Surfactants (Alveofact) war ein umgekehrtes Verhalten zu beobachten. Die Messungen zur Kinetik des kolloidalen Systems erfolgten mit der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie. Mit dieser Methode wurde der Einfluss der Ionenkonzentration und von Alveofact auf die Aggregationskinetik von verschiedenen positiv geladenen Gentransfer-Komplexen untersucht. Die Experimente zeigten, dass die Geschwindigkeit der kolloidalen Aggregation mit der Ionenkonzentration drastisch zunimmt und die mittlere Zahl der Plasmide pro Komplex als Funktion der Zeit linear ansteigt. Nach der Inkubation mit Alveofact stellten die Polyplexe auch unter physiologischen Bedingungen ein stabiles kolloidales System dar und bestanden im Mittel aus 3-5 Plasmiden. Auch in diesem Fall wurde bei den DNA/Lipofectamine-Komplexen ein anderes Aggregationsverhalten beobachtet. Sie bildeten ohne die Einwirkung von Alveofact unabh\xe4ngig von der Ionenkonzentration ein stabiles Kolloid und bestanden im Mittel aus nur zwei kondensierten Plasmiden. Dagegen f\xfchrte die Inkubation mit Alveofact zu einer langsamen kolloidalen Aggregation. Die Lipoplexe erreichten in diesem Fall nach 60 min eine Gr\xf6\xdfe von ~3-4 Plasmiden pro Komplex.\n\nMit Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie wurde das Transportverhalten verschiedener Vesikel und Gentransfer-Komplexe in einem negativ geladenen Polymer-Netzwerk (Mucin) untersucht. Die Gr\xf6\xdfe und die Ladung der Partikel bestimmten die Diffusion durch das Polymer-Netzwerk. Kleinere Durchmesser und h\xf6here negative Ladungen der Vesikel trugen zu einem effektiveren Transport durch das Netzwerk bei. Aus der Diffusionskonstante und der makroskopischen Viskosit\xe4t der Polymerl\xf6sung wurden die Abweichungen von der Stokes-Einstein-Relation berechnet. Das Diffusionsverhalten anionischer Vesikel wurde zum Vergleich auch in einem positiv geladenen Kollagen-Netzwerk studiert. Bei den synthetischen Gentransfer-Komplexen mit positiver \xdcberschussladung wurde auf Grund der Bindung zum Netzwerk ein deutlicher Abfall der Diffusionskonstante als Funktion der Polymer-Konzentration beobachtet. Im Unterschied dazu zeichneten sich die negativ geladenen Komplexe wegen der repulsiven elektrostatischen Wechselwirkung durch einen effektiveren Transport im Mucin-Netzwerk aus. Unter dem Einfluss von Alveofact zeigten die positiv geladenen Komplexe ein \xe4hnliches Transportverhalten wie die negativ geladenen Komplexe. Eine gezielte Beschichtung der Komplexe erm\xf6glichte also einen verbesserten Transport durch das Polymer-Netzwerk, was im Zusammenhang mit einem effizienten Gentransfer von Interesse ist.