Selenoprotein-Biosynthese in Archaea
Ziel dieser Arbeit war es, die aus der Genomsequenz von M. jannaschii identifizierten\nKomponenten der Biosynthese und Inkorporation von Selenocystein biochemisch und molekularbiologisch\nzu charakterisieren. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:\na) Die tRNASec von M. jannaschii konnte mit gereinigter Seryl-tRNA-Synthetase von E. coli\nkorrekt in vitro mit L-Serin beladen werden. Die Umwandlung der Seryl-Gruppe in eine\nSelenocysteyl-Gruppe war mit gereinigter Selenocystein-Synthase und Selenophosphat-\nSynthetase von E. coli ebenfalls erfolgreich. In Extrakten von M. jannaschii konnte dar\xfcber\nhinaus die Selenocystein-Synthase-Aktivit\xe4t nachgewiesen werden. Eine rekombinante\ntRNASec von M. maripaludis, bei der eine Base im Anticodon-"Loop"ausgetauscht worden\nwar, konnte im heterologen Wirt E. coli Selenocystein inserieren.\nb) Die Natur und die Lokalisation des archaeellen SECIS-Elements konnte durch die heterologe\nExpression eines Selenoprotein-Gens von M. jannaschii in M. maripaludis bewiesen werden.\nDie heterologe Selenoprotein-Synthese war dabei abh\xe4ngig vom Vorhandensein und der\nstrukturellen Unversehrtheit des RNA-Elements in der 3'-nicht-translatierten Region der\nSelenoprotein-mRNA.\nc) Die biochemische Charakterisierung des heterolog in E. coli \xfcberproduzierten MJ0495-\nProteins von M. jannaschii ergab Dissoziationskonstanten f\xfcr Guanin-Nukleotide, wie sie f\xfcr\nbakterielle SelB-Spezies typisch sind. Dar\xfcber hinaus diskriminiert das MJ0495-Protein\nzwischen der kognaten Ser-tRNASec und Sec-tRNASec; letztere wird mit h\xf6herer Affinit\xe4t\ngebunden. MJ0495 stellt deshalb den Selenocystein-spezifischen Translationsfaktor in\nArchaea (aSelB) dar. Das in der nicht-translatierten mRNA-Region liegende SECIS-Element\nwird allerdings (im Unterschied zu SelB von E. coli) nicht von aSelB gebunden.\nd) Es konnten mehrere SECIS-bindende, und ein aSelB-bindendes Protein identifiziert werden,\ndie m\xf6glicherweise f\xfcr die notwendige Kommunikation zwischen aSelB und dem SECISElement\nsorgen.\ne) Durch die Proteomanalyse konnte gezeigt werden, dass in M. maripaludis einige Proteine in\nAbh\xe4ngigkeit von der Selenversorgung gebildet werden. Dabei wurden auch solche Proteine\nselenabh\xe4ngig synthetisiert, die kein Selenocystein enthalten.