BROADCASTS.com

1. Es wurde eine Methode entwickelt, die POR nach der Solubilisierung aus Etioplasten\nchromatographisch zur Homogenit\xe4t zu reinigen. Die spezifische Aktivit\xe4t konnte\ngegen\xfcber der POR in Etioplasten ann\xe4hernd um das 14-fache gesteigert werden. Dabei\nwurden alle endogenen Pigmente und Lipide abgetrennt. So konnte erstmals \xfcberzeugend\nmit isolierter POR aus Pflanzen gezeigt werden, da\xdf eine Bindung an das Substrat oder\ndas Vorhandensein einer Membranumgebung keine Voraussetzung f\xfcr den Erhalt der\nAktivit\xe4t darstellt.\n2. Mittels detaillierter Pigment- und Proteinanalysen, inklusive densitometrischer Verfahren,\nkonnte nachgewiesen werden, da\xdf in Etioplasten ein Molek\xfcl Pchlide a an ein Molek\xfcl\nPOR gebunden ist.\n3. Substratspezifit\xe4tsstudien mit Substratanalogen zu Pchlide a zeigten, da\xdf strukturelle\nVer\xe4nderungen an den Seitenketten des Porphyrinringes A und B, nicht aber\nModifikationen am Ring D oder am isozyklischen Ring E, von der POR akzeptiert\nwerden und zu photokonvertierbaren Substraten f\xfchren. Die Ergebnisse dieser Versuche\nlieferten ein neues Modell zu dem Mechanismus der Katalyse. Demzufolge sind die\nRinge D und E am Boden der Enzymtasche fixiert und eine Enolatbildung an der\nCarbonylgruppe des Ringes E an der die Reaktion beteiligt. Die Ringe A und B liegen\nmehr oder weniger au\xdferhalb der Enzymtasche.\nErstmals konnte die Photokonvertierbarkeit von Pchlide b, Zn-[3-acetyl]-Protopheide a\nund Zn-[3-formyl]-Protopheide a gezeigt werden.\n4. Kinetische Untersuchungen mit den Substratanalogen stellten die Auswirkungen der\nverschiedenen Seitenkettenmodifikationen auf die Reaktionsgeschwindigkeit heraus. Die\nPigmente lie\xdfen sich in drei Gruppen mit einer \u201eschnellen\u201c (z. B. Pchlide a), einer\n\u201emittelschnellen\u201c (z. B. [8-Vinyl]-Pchlide a) und einer \u201elangsamen\u201c\n(z. B. Zn-71-OH-Protopheide a) Reaktionsgeschwindigkeit einteilen. Ein komplement\xe4rer\nZusammenhang zwischen Fluoreszenz- und Photoreaktion-Quantenausbeute konnte nicht\nfestgestellt werden.\n5. \xdcber die Bestimmung der KM-Werte f\xfcr Pchlide a und Pchlide b (0,47 \xb5M, respektive\n0,63 \xb5M) wurde demonstriert da\xdf die Affinit\xe4t beider Pigmente zu der PORA aus Hafer\nann\xe4hernd gleich gro\xdf ist. Chlorophyll c1 konnte als kompetetiver Hemmstoff f\xfcr die\nPOR identifiziert werden.\n6. Bei der Photoreduktion tritt Substrathemmung auf. Dies konnte bei einem \xdcberschu\xdf an\nPchlide a oder Pchlide b gegen\xfcber der POR (> 1 mol Substrat/1 mol POR) gezeigt\nwerden.\n7. An solubilisierten Etioplastenmembranen und an solubilisierter, weitgehend\naufgereinigter POR konnten die unterschiedlichen spektralen in vivo-Formen des\nphotoaktiven endogenen Pchlide a dargestellt werden. Die nach der Photoreduktion\nauftretende spektrale Verschiebung des Chlide a (von A680 nm nach A672 nm), die mit\ndem in vivo auftretenden Shibata-Shift vergleichbar ist, konnte in diesen Proben gezeigt\nwerden. Die in der Literatur postulierte Ursache des Shibata-Shift`s, eine Freisetzung des Chlide a aus den tern\xe4ren Komplexen (POR-NADPH-Chlide a), kann anhand der hier\nerzielten Ergebnisse best\xe4tigt werden.\n8. Es wurde eine Methode entwickelt, mit deren Hilfe an solubilisierter und zur\nHomogenit\xe4t gereinigter POR erstmals der Einflu\xdf von Lipiden auf den spektralen\nVerlauf der Photoreduktion gezeigt werden kann. Nach der Dialyse\neiner Mischung von Einzelkomponenten (gereinigte POR, NADPH,\nMGDG/DGDG/Zn-Protopheide a-Gemisch) gegen 80 % Glycerin konnte die\nPhotoumwandlung langwellig-absorbierender tern\xe4rer Komplexe, sowie die mit dem\nShibata-Shift vergleichbare Verschiebung des Produktes in vitro dargestellt werden.\n9. Die Ergebnisse dieser Rekonstitutionsversuche weisen darauf hin, da\xdf in vivo die\nEinbettung der tern\xe4ren Komplexe in die spezielle Lipidumgebung der Prolamellark\xf6rper\nf\xfcr die Bildung von unterschiedlich absorbierenden spektralen Formen des photoaktiven\nPchlide a verantwortlich sind.