BROADCASTS.com

1.Die A1-ATPase-Gene ahaE, ahaC, ahaF, ahaA, ahaB, ahaD und ahaG wurden in\nden Fusionsvektor pMal-c2 kloniert und in Escherichia coli exprimiert.Die\nFusionsproteine wurden aus dem Zellextrakt isoliert und zur Immunisierung von\nKaninchen eingesetzt.Die spezifischen Antiseren gegen die A1-ATPase-\nUntereinheiten AhaA,AhaB,AhaC,AhaE und AhaF wurden f\xfcr die Studien\ndieser Arbeit eingesetzt.\n2.Die f\xfcr die hydrophile Dom\xe4ne der A1-ATPase kodierenden Gene ahaE, ahaC,\nahaF, ahaA, ahaB, ahaD und ahaG des methanogenen Arch\xe4ons Methanosarcina\nmazei G\xf61 wurden in den \xdcberexpressionsvektor pGEM-4Z hinter die lac und\nT7-Promotoren kloniert.Dieses Konstrukt wurde pTL2 genannt.pTL2 enth\xe4lt\nzus\xe4tzlich 162 Bp stromaufw\xe4rts von ahaE\n3.Die auf pTL2 lokalisierten Gene wurden heterolog in E. coli DK8 exprimiert und\ndie A1-ATPase funktionell synthetisiert.Die spezifische ATPase-Aktivit\xe4t im\nzellfreien Extrakt von E. coli DK8 (pS\xd61)betrug 186 mU/mg Protein.Die\nSynthese der A1-ATPase-Untereinheiten AhaA,AhaB,AhaC und AhaF konnte\nnachgewiesen werden.AhaE und AhaG konnten nicht detektiert werden.\n4.Die A1-ATPase wurde aus dem Zellextrakt von E. coli DK8 (pTL2)\xfcber Ultra-\nzentrifugation,Ammoniumsulfatf\xe4llung,Gelfiltration an BioPrep SE 1000/17,\nIonenaustauschchromatographie an BioScale DEAE und einer zweiten\nGelfiltration an Sephacryl S-300 HR bis zur apparenten Homogenit\xe4t gereinigt.\n5.Das gereinigte Enzym wies eine molekulare Masse von 355 kDa auf und setzte\nsich aus 5 verschiedenen Untereinheiten zusammen.Die einzelnen Untereinheiten\nAhaA (65 kDa),AhaB (55 kDa),AhaC (41 kDa),AhaD (28 kDa)und AhaF\n(9 kDa)wurden mittels N-terminaler Sequenzierung identifiziert und wiesen im\nATPase-Komplex eine St\xf6chiometrie von A3B3CDF auf.AhaE und AhaG waren\nnicht im Komplex enthalten.\n6.Der ATPase-Testpuffer wurde f\xfcr die heterolog exprimierte A1-ATPase optimiert\n(50 mM MES-HCl,40 mM Na-Acetat,30 mM NaHSO3,8 mM MgSO4,4 mM\nATP,pH 5,2).Na-Acetat und Sulfit stimulieren die A1-A7.Die gereinigte A1-ATPase aus M. mazei G\xf61 hydrolysierte Mg-ATP (im\nVerh\xe4ltnis 2:1)als bevorzugtes Substrat mit einem V von 13 \xb1 3 U/mg Protein\nund einem K von 1,3 \xb1 0,3 mM f\xfcr ATP.\n8.DES,Hexestrol und Dienestrol wurden als spezifische Inhibitoren der arch\xe4ellen\nA1-ATPase identifiziert.Die I Werte dieser Hemmstoffe betrugen 5 \xb5mol\nHexestrol/mg Protein,3 \xb5mol DES/mg Protein und 6 \xb5mol Dienestrol/mg Protein.\n9.Quervernetzungsexperimente konnten belegen,dass die Kopien der Untereinheit\nAhaA in direkter Nachbarschaft zueinander stehen.Dies trifft auch f\xfcr die Kopien\nder Untereinheit AhaB und f\xfcr die Untereinheiten AhaA und AhaB untereinander\nzu.Zudem konnte eine direkte Nachbarschaft der Untereinheiten AhaA und AhaD\nfestgestellt werden.\n10.Die A1-ATPase besitzt eine dreifache Achsensymmetrie.Der Kopfteil der A1-ATPase\nist hexagonal geformt und setzt sich aus sechs peripheren und einer\nzentralen Masse zusammen.\n11.Die \xfcber R\xf6ntgenkleinwinkelstreuung ermittelten Dimensionen der A1-ATPase\nsind:Gesamtl\xe4nge =17,8 nm,L\xe4nge Kopfteil =9,4 nm,Stiell\xe4nge =8,4 nm,\nStieldurchmesser =6 nm,Kopfdurchmesser (variabel,abh\xe4ngig vom Substrat)=\n10,06 nm,Kopfradius (variabel,abh\xe4ngig vom Substrat)=5,03 nm. TPase,wohingegen sich\nalkoholische L\xf6sungsmittel die ATPase-Aktivit\xe4t hemmten.